高效液相色谱的使用讲述.ppt

HPLC色谱柱选择与维护保养 Sa 安捷伦科技 ? 安捷伦HPLC色谱柱选择 分离模式的选择 样品 溶于有机溶剂 溶于水 溶于四氢呋喃 非离子化 离子化 溶于有机溶剂 溶于水 溶于正己烷 溶于甲醇或甲醇/水 或乙腈或乙腈/水 用硅胶的正相模式 用键合相的正相模式 用键合相的反相模式 用键合相的反相模式 低分子凝胶渗透色谱 用键合相的反相模式 抑制电离反相键合相色谱 离子对键合相的反相模式 用硅胶的正相模式 离子交换模式 凝胶渗透色谱 凝胶过滤色谱 大孔填料的离子交换模式 用大孔填料的反相模式 分子量2, 000 分子量2, 000 反相分配色谱 极性:固定相 流动相 固定相 - 非极性 流动相(甲, 乙醇, 乙腈, THF, 二氯乙烷)- 极性 非极性物质后出峰 正相吸附色谱 极性:固定相 流动相 固定相 - 极性 流动相(己烷, 庚烷)- 非极性 极性物质后出峰 正相色谱 20% 反相色谱 80% 正相 反相色谱 硅胶基质- pH 3~8 Al2O3 . nH2O - pH1~14 聚合物基质 - pH1~14 高或低pH下, 硅胶会溶解 化学修饰困难 孔结构复杂, 孔径不均匀导致柱效不够高, 有机溶剂可能导致聚合物基质溶涨而受损 柱填料基质 C-18柱---性能影响因素 硅胶纯度 ? 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 ? 填料床的长度和内径 颗粒形状 ? 球型或不规则型 粒径 ? 平均颗粒直径, 通常3-10μm 表面积 ? 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gram表示 孔径 ? 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300? 色谱柱物理性质 C-18柱---性能影响因素 键合类型 ? 单体键合 - 键合相分子与基体单点相连 ? 聚合体键合 - 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 ? 与基体物质相连的键合相的量 封端 ? 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键合后封闭起来 色谱柱化学性质 C-18柱---性能影响因素 A类硅胶 Original ZORBAX SIL (1970s) 由于带负电荷的残留硅羟基和酸性表面上金属含量高 (硅羟基的pKa低), 导致碱性化合物发生拖尾 B类硅胶 (高纯) ZORBAX Rx-Sil (1987) 由于金属含量低, 硅羟基pKa高, 碱性化合物不发生拖尾 Zorbax Rx-SIL: 11种金属 35 ppm (未检出其他杂质, 1ppm); 99.995% 纯度的二氧化硅 C-18柱---性能影响因素 ZORBAX?生产工艺 微球表面的略微融合专利技术增强了硅胶填料的耐流动相冲刷能力---Zorbax色谱柱使用寿命长的技术保障 安捷伦拥有此项溶胶-凝胶填料专利技术 StableBond Eclipse XDB Bonus-RP Extend ZORBAX Rx 多孔硅胶微球 色谱柱尺寸 --- 对色谱分离的影响 ? 短柱 (15-100mm) - 运行时间短, 柱压低 ? 长柱 (150-250mm) - 分辨率高, 运行时间长 ? 窄径柱 (? 2.1mm) - 检测器灵敏度高 ? 宽径柱 (3-21.2mm) - 载样量高 C-18柱---性能影响因素 颗粒形状 --- 对色谱分离的影响 当使用黏度较大的流动相50:50=MeOH:H2O时, 球型颗粒可以降低柱压, 延长色谱柱寿命 C-18柱---性能影响因素 球形 不规则形 粒径 --- 对色谱分离的影响 较小的颗粒柱效较高, 但会引起柱压过高. 3.5μm粒径的常用于分离复杂的多组份样品, 而组份单一的样品多采用5μm的粒径 1.8μm 3.5μm 5μm 7μm 10μm 表面积 --- 对色谱分离的影响 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力, 柱容量和分离度. 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要 C-18柱---性能影响因素 孔径 --- 对色谱分离的影响 大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 样品 MW ? 4, 000, 选择 80? 的孔径 样品 MW 4, 000, 选择 300? 的孔径 大孔径填料适用于大分子分析 大孔径300? 全多孔色谱柱 可用于分离蛋白质和多肽 分子量虽小但hydrodynamic v