DIG试剂盒说明书.doc

PAGE  PAGE 17 只用于生命科学研究，不能用于诊断程序 仅用于体外实验 DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。 货号：11 093 657 910 此试剂盒储存条件：-15℃到-25℃。 此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应， 可检测10×10cm2面积的杂交膜50张 指导手册 1 前言 1.1 内容表 1 前言 1.1 内容表 1.2 试剂盒成分 2.介绍 2.1 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 3.1 在你开始前 3.2 流程图 3.3 地高辛标记DNA 3.4 标记效率的确定 3.5 DNA的转移和固定 3.6 杂交 3.7 免疫检测 3.8 DNA印记的洗脱和再杂交 1.2 试剂盒的成分 瓶号标记内容 包括功能1无标记对照DNA1此管内有20μl pBR328 DNA100μg/ml,pBR328分别用BamHⅠ,BglⅠt HinfⅠ消化，它们的混合比例为2：3：3，共有16个Pbr328片段，这些片段的大小分别为：4907，2176，1766，1230，1033，653，517，453，298×2，234，234，220和154×2bp2无标记对照DNA2此管内有20μl pBR328 DNA200μg/ml，已用EcoRⅠ线性化3DNA稀释缓冲液有两管，每管1ml[成分为：Tris-HCl(10mmol/L),EDTA(1mmol/L),pH8.0(20℃)]内含鲑鱼精DNA（50μg/ml）4DIG标记的对照DNA此管内有50μl线性化pBR328DNA，按标记方法已标记有地高辛配基dUTP,含20μg模板DNA，每毫升含5μg合成的标记DNA5六聚核苷酸混合物6标记用混合物此管内有50μl 10倍浓度的dNTP标记用混合底物，含dATP（1mmol/L）dCTP(1mmol/L),dGTP(1mmol/L),dTTP(0.65mmol/L)和Dig-dUTP(0.35mmol/L),pH6.5(20℃)7DNA聚合酶1大片段此管内有25μl DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow），2U/μl8抗地高辛的碱性磷酸酶结合物此管内有200μl多克隆羊抗地高辛配基Fab-片段，结合有碱性磷酸酶750U/ml9NBT/BCIP10封阻试剂有两瓶，每瓶有50g粉剂附加仪器与所需试剂 除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。 在每个操作程序的前面提供了详细的信息。 操作程序仪器设备试剂3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水 0.2M pH8.0 灭菌的EDTA3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜*地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液 或者洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备2×SSC 或者10×SSC3.6 杂交尼龙膜，带正电荷* 杂交袋*，或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶（分子杂交炉） 注意：当用地高辛杂交缓冲液工作时，不要用开口的托盘。DIG Easy Hyb （杂交缓冲液，需单独购买）3.7 免疫检测 耐热的塑料袋或者滚筒瓶 杂交袋*地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液 或者洗涤缓冲液 马来酸缓冲液 检测缓冲液3.8 DNA 斑点的脱色和重新标记探针大的托盘 水浴DMF 0.2M NaOH，0.1%SDS 2×SSC *标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。 2.介绍 2.1 产品概况 实验原则 此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA探针用于杂交和后续的免疫检测。 步骤描述DNA 标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab段，然后采用即时可用的化学发光底物NBT/BCIP可以看到杂交结果