DNA电泳实验报告杨家庆汇编.docx

浙江农林大学实验室开放项目DNA和蛋白质的电泳技术 姓 名：杨家庆 班 级：测绘工程151班 学 号：201518080113 指导老师：杨仙玉完成时间：2016 年11月23日一、实验名称：DNA的电泳技术二、实验目的：琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。三、实验原理：琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。四、实验器材：仪器：制胶模具、电泳槽、电泳仪、烧杯、锥形瓶、移液枪、手套、微波炉、凝胶成像仪、分析天平、钥匙、离心机、紫外线透射仪、干式恒温器等。试剂：琼脂糖（白色粉末）、TAE缓冲液、EB（溴化乙锭-致癌剂，操作中要严格戴手套）；实验步骤：（一）DNA电泳实验模板胶的制作：①.称取1g琼脂糖加入盛有100mL的1*TAE溶液中，混合均匀后用微波炉加热至沸腾，加热2-3次，每次沸腾之后取出摇匀，直至混合均匀；②.待溶液冷却至40-50℃时，倒入制胶模具内（注意要快速倒入，以防倒入的过程中溶液凝胶），凝固后，上DNA样品；③.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；④.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；⑤.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。2.DNA凝胶回收：①.称量凝胶重量，按质量：体积=1:1换算，再按凝胶：Buffer G=1:3加入3倍的Buffer G溶液放入干湿恒温机中加热融化；②.将溶液转入2ml离心管中，离心30s（13200rmp/min）；③.在离心管中再加入500微升的Buffer WS溶液，离心30s；④.加入700微升的WG溶液，离心30s；⑤.离心结束后，倒掉废液，将空的离心管放入离心机空转30s或1min，将DNA中的残留液体甩干净；⑥．离心结束后，将含有DNA的薄片快速取出（为防止剩余的酒精再次挥发进入）；⑦.在放置DNA薄片的离心管中加入20微升的水（水要从中间加入，打在DNA薄片上，待DNA溶于水），静置1min，离心；⑧．清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。凝胶回收后DNA片段的电泳：①.将胶从凝胶成像仪中取出，在相对黑暗的条件下用紫外光照射，看到清晰地六条条带之后，将相应的条带逐条切下（切的时候尽可能薄，每个条带的重量不要超过0.3g），做凝胶回收，得到相应的DNA分子；②．重复制胶过程，在得到的模具中重复上样过程，在第一个孔内上标准DNA样品，其余孔内加入相应波长DNA样品；③.上样后，将模具移入电泳槽，将样品端上到负极，通电，恒压120V，25-30min；④.将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；⑤.清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。PCR（Polymerase chain reaction,聚合酶链式反应）实验：１、配置反应所需试剂：反应体系为20微升，首先加入14微升水，然后依次加入2微升10*Ｂ（buffer）、0.8微升DNTPs（四种脱氧核苷酸混合物）、１微升cDNA（模板DNA）、１微升引物１、1微升引物２（引物1、２方向相反）、以及0.2微升Taq（DNA聚合酶）；溶液配置好之后，对溶液溶液进行预变性处理，条件95℃，时间2-5min；预处理过后，进行变性操作，条件94℃，时间30ｓ，之后，进行退活，条件58℃时间30s，然后延长反应，72℃、30ｓ；重复步骤３，共循环35次；循环过程结束，在72℃下保存８min；制作琼脂糖凝胶，将样品与５微升loading buffer溶液混合，上样，进行电泳；７、将胶移入凝胶成像仪，用紫外光观察，拍照存档，保存图片；８、清理实验相关物品，整理实验器材，实验结束。六、实验结果：标准DNA上样后成像为（如下左图）：从上到下六条分带分别代表不同大小的DNA分子片段，带的粗细表现该片段的含量的多少，如图，从上到下每个条带一次对应的DNA分子片段的大小为:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。凝胶回收后，各个不同片段的条带与MARKER带的对比成像为（如下右图），其中，最亮的条带对应的DNA量是150ng,其余的均为50ngPCR实验结果成图为结果讨