树突状细胞的分离纯化与鉴定.PDFVIP

树突状细胞的分离纯化与鉴定 自从 Stciman首次发现树突状细胞(dendritic cell ,DC) 以来, 人们对DC的认识随着它的 分离与纯化技术的改进而逐步深入, 认识的深入又进一步促进了 DC 分离与纯化技术的提 高。现已能够从大多数组织中得到高纯度的、各具特异性的 DC。DC 的纯化方法包括两大 类: (1) 物理方法: ①根据细胞的黏附性进行分离, 有黏附分离法、尼龙毛分离法、羰基碳分离法, 各种 淋巴细胞的黏附能力依次为巨噬细胞 DC = 抗体产生细胞 B细胞 T细胞; ②根据细胞的 大小比重进行分离, 包括聚蔗糖 2泛影葡胺( Ficoll2 Paque) 密度梯度离心、Percoll非连续性 / 连续性密度梯度离心、E花环沉淀分离; (2) 免疫分选: 包括淘洗法( Pan2 ning) 、流式细 胞术(fluid cytometry ,FCM) 、磁性细胞分离术 (MACS) 。以下就不同组织 DC的分离作一 综述。 1 从外周血直接分离 DC 首先分离外周血单个核细胞( PBMC) 。常用方法有: (1) Ficoll 不连续密度梯度离心, 将人外周抗凝血稀释置于 Ficoll2Paque 淋巴细胞分离液上 离心, 速度(170 g～1 000 g)和时间(20～45 min) 因各个实验室而异, 分离液与血浆之间的界 面层细胞即是 PBMC; (2) Percoll连续/ 不连续密度梯度离心: 方法基本与密度梯度离心相同, 可在 Ficoll不连续密度梯度离心的基础上进一步纯化 DC。玫瑰花沉淀法大体上可将 PBMC 分为 ER+ 和 ER 2细胞,其中 ER+ 主要是 T细胞。Nijman采用磁珠阴性选择法, 即用与抗 CD14、CD15、CD16、CD19、CD56 单抗相连的磁珠分别去除 ER2 细胞中的单核细胞、B 细胞、NK 细胞和粒细胞, 所得的“新鲜 DC”(f2DC) 纯度经流式细胞术(FACS) 检测达到 85 %～90 %。如果将 ER2细胞培养 36 h再加 2次各 40 min贴壁培养去除黏附细胞, 将未黏 附细胞置于 1415 %甲泛葡胺上离心去除 B细胞、NK细胞, 可得到 90 %～95 %纯度的“培 养 DC” (c2DC) 。f2DC和 c2DC分别具有未成熟 DC和成熟 DC的典型特征。 Young 的一种方法是用 Percoll 分离液先分离 PBMC 中的单核细胞, 或玫瑰花法得到的经短 暂培养去除黏附细胞的 ER2细胞; 另一种方法是先用玫瑰花节法分离出 ER2细胞, 培养 36 h 去除单核细胞和黏附细胞, 两种方法最后将所得细胞经 Percoll密度梯度离心, 高 密度部分富含 B细胞, 低密度部分 DC纯度为 40 %～80 %Thomas则用 L亮胺酰 2L亮胺酸 2甲基酯(LLME) 处理 ER2细胞以杀死去除单核细胞和有细胞毒作用的细胞, 再经 14-15 % 1 的甲泛匍胺RPMI 1640溶液(含 10 % FCS) 离心, 低密度部分富含DC; 再用免疫磁珠分选出 CD14、CD19、CD16、CD3和 CD33 + CD14dim细胞, 证实为 DC前体细胞, 90 %表达 CD33 + CD13 +。最近有报道用免疫磁珠连接单抗M2DC8从 PBMC中一步分离出一类 DC (占血 白细胞 015 %～1 %) , 其纯度为 97 % , 这可能是至今为止最简捷的分离方法。该细胞具有 DC的典型特征: 递呈抗原给静息 T细胞、诱导MHC I限制性 CTL应答, 表达 CD86、CD40。 与单核细胞相比, 它低水平地表达 HLA2DR、CD33、CD45RO , 高水平地表达 CD45RA、 CD11c , 它特别高水平地表达 FcγR III (CD16) , 使它与单核细胞区别开来。这类细胞与已 经确立的一般骨髓源性 DC的区别在于表达 M2DC8 , 缺少 CD83和胞浆内 p55抗原, 因此 它可能代表中间阶段(intermediate developmental stage) 的 DC细胞。 2 从 DC前体诱导扩增 DC 从 CD34 + 干细胞前体诱导扩增 DCCaux用抗 CD34 mAb和 GAM IgG免疫磁珠、 minimacs分离柱从人脐血中获得高纯度的 CD34 + HPCs (80 %～99 %) ,将其置于 RPMI 1640全培养基中(加有 SCF、GM2CSF和 TNF2α及人 AB+ 血清) 培养; 5～ 6 d后洗去人血清, 用 FITC2OKT6 (CD1a) 和 PF2leu2M3 (CD14) 单抗标记培养细 胞, 经流式细胞仪分选出 CD14 + CD1a和