第九章吸光光光度法.pptVIP

 第九章 ?? 吸光光光度法 分光光度法 根据物质的吸收光谱（λυ）及光的 吸收定律，对物质进行定性、定量分析的一种方法。 第一节 物质的吸收光谱 一、物质对光的选择性吸收 物质对光的吸收具有选择性，若溶液选择性地吸收了某种颜色的光，则溶液呈吸收光的互补光。 二．物质的吸收光谱(A-λ图） 以波长?为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱(absorption spectrum)或称吸收曲线(absorption curve),右图为不同浓度时三(邻二氮菲)合铁(II)配离子的吸收光谱。 特点: ① 具有最大吸收波长。 ②不同物质, λmax不同，λmax 是定性分析的依据。 ③λmax几乎不随物质的浓度而变。 ④λmax附近，A最大，并与浓度c呈正比关系 ---- 定量分析依据。 ⑤远离λmax的光,物质几乎不吸收光（A→0）,这些光的A与物质的c无直接关系----不作定量分析依据。 注意：物质对光的吸收越多，呈颜色越深，溶液浓度越浓。 第二节????分光光度法?基本原理 一、透光率和吸光度 入射光 I0 ? 吸收Ia ?透射It I0= Ia+ It 透光率 T = It/ I0 二? Lambert―Beer 定律 当 I0 一定时，A只与液层厚度（b）和 溶液浓度C 有关： ① Io，c 一定, A∝b ② Io，b 一定, A∝c ∴ A = εbc or A = abr 注意： Beer定律仅适用于单色光。 单位： 　b ---- cm。 　a为吸光系数：L g-1 cm-1 , c单位:g/L。 ε为摩尔吸光系数：L·mol-1·cm-1，c单位：mol/L-1， a与ε的关系:ε= aM 　M表示被测物质的摩尔质量。 由Lambert―beer定律 可知吸光度与溶液浓度之间为正比关系，而透光率与溶液浓度之间为指数函数 关系：-lgT = ?bc T =10-?bc 例9-1：已知某化合物的相对分子质量为251，将此化合物用乙醇配成浓度为0.150 mmol?L-1的溶液，在480 nm波长处用2.00 cm吸收池测得透光率为39.8%，求该化合物在上述条件下的摩尔吸光系数?及质量吸光系数a。 解： 例9-2：测试酶与腺苷酸(AMP)体系的吸光度如下 A(280nm) = 0.46， A(260nm) = 0.58， 试计算 每一组分的浓度。 已知：酶的?(280nm) = 2.96?104 L?mol-1?cm-1 　　　　　?(260nm) = 1.52?104 L?mol-1?cm-1 　　　AMP的?(280nm) = 2.4?103 L?mol-1?cm-1 　　　　　　?(260nm) = 1.5?104 L?mol-1?cm-1 　　　吸收池厚度为1.00cm。 第三节 可见分光光度法 一 分光光度计 　分光光度计仪器型号很多，但其基本原理相似，其主要部件用方框图示意如下　光源 →单色光器 →吸收池 →检测器 →讯号处理 及显示器 二、测定方法 　　　可见分光光度法常用于定量测定，根据Lambert-Beer定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，就可以通过下列方法即可求出被测物质含量: 1.标准曲线法 在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响，必须采用空白溶液(又称参比溶液)作对照。常用的空白溶液有下列三种。①溶剂空白 ②试剂空白 ③试样空白 2. 标准对照法 先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液(其浓度用cs表示)，在?max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cs可按下式求得： cx = cs Ax/As 第四节?提高测量灵敏度和准确度的方法 一、分光光度法的误差 　　分光光度法的误差主要来自以下几方面： 1.溶液偏离Beer定律引起的误差 测定条件：均匀稳定的稀溶液，单色光。 2.仪器误差，A为 0.2～0.7, 误差较小。 3.主观误差。 二　选择合适的显色剂 合适的显色剂必须具备的条件： 1.灵敏度 　　2.选择性高 　　3.生成的有色物质有确定的组成 　　4.生成的有色物质要稳定