SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是HCL缓冲系统，浓缩胶是，分离胶.pdfVIP

1. 配胶缓冲液系统对电泳的影响？ 在 SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是 Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是 pH6.7，分离胶 pH8.9； 而电泳缓冲液使用的 Tris－甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其 pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其 在电场的作用下，泳动效率低；而 CL离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者 之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一 起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中 pH 的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动 速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的 带电性和分子大小进行分离。 所以，pH 对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情 况，应首要考虑该因素。 2. 样品如何处理？ 根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原 SDS 处理、非还原 SDS 处理、带有烷基化作用的 还原 SDS处理。 1）还原 SDS处理：在上样 buffer中加入 SDS和 DTT（或 Beta巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷 被中和，形成 SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理， 样品稀释适当浓度，加入上样 Buffer，离心，沸水煮 5min，再离心加样。 2）带有烷基化作用的还原 SDS 处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护 SH 基团， 得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的 DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中 10ul 20％ 的碘乙酸胺，并在室温保温 30min。 3）非还原 SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用 1％SDS沸水中煮 3min，未加还原剂， 因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。 3. SDS电泳凝胶中各主要成分的作用？ 聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与 促凝剂及环境密切相关； 制胶缓冲液：浓缩胶选择 pH6.7，分离胶选择 pH8.9，选择 tris－HCL系统，TEMED与 AP：AP提供自由 基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合反应进行；十二烷基硫酸钠（SDS）：阳离子去污剂，作用有 四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。 4. 提高 SDS电泳分辨率的途径？ 聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一 段时间使用。忌即配即用或 4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致 SDS结晶。一般凝胶可在 室温下保存 4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。 一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照 郭尧君编著的《蛋白质电泳技术手册》P82-103。 5.“ 微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？ 主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再作后续实验。 6. “皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？ 主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。 处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。 7. 为什么带出现拖尾现象？ 主要是样品融解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液时间过长，重新配 制；降低凝胶浓度。 8. 为什么带出现纹理现象？ 主要是样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心；加适量样品促溶剂。 9. 什么是“鬼带”，如何处理？ “鬼带”就是在跑大分子构象复杂的蛋白质分子时，常会出现在泳道顶端（有时在浓缩胶中）的一些 大分子未知条带或加样孔底部有沉淀，主要由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解 离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入 分离胶。但它却于目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。 处理办法：在加热煮沸后，再添加适量的 DTT或 Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；或可加适量 EDTA 来阻止还原剂的氧化。 10. 为什么溴酚蓝不能起到指示作用？ 我们在实验中常会遇到溴酚