05.重组技术概述摘要.ppt

分子生物学检验技术;DNA重组技术的诞生;20世纪50年代 —— 70年代初：;20世纪50年代 —— 70年代初：;20世纪50年代 —— 70年代初：;70年代以后：;DNA重组技术的诞生;DNA重组技术的诞生;DNA重组技术的定义;DNA重组技术 按照人的意愿，将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后将重组分子导入宿主（受体）细胞内，使之在细胞中扩增，以获得该DNA分子的大量拷贝，表达相关基因的产物。也称为分子克隆（molecular cloning）技术，是进行基因功能研究的基本方法之一;DNA重组技术的重大意义;DNA重组技术的基本步骤;基因克隆的策略和技术路线 ; 核酸酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸修饰酶 ;核酸酶 (nuclease); 核酸外切酶III (Exo III) ① 酶切双链，需Mg2+; ② 从3’端开始外切;; λ核酸外切酶 (λExo) ① 酶切双链，需Mg2+; ② 从5’端开始外切;;核酸酶 (nuclease);限制性核酸内切酶 (Restriction endonuclease);限制性核酸内切酶 (Restriction endonuclease);限制性核酸内切酶 (Restriction endonuclease);II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;Sma I;BamH I;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;II型限制性核酸内切酶;DNA连接酶 (Ligase);DNA连接酶 (DNA Ligase); 修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键; 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键;DNA连接酶 (Ligase);DNA多聚酶 (Polymerase); 大肠杆菌DNA聚合酶 I (全酶) ① 5′→3′的聚合酶活性; ② 5′→3′脱氧核酸外切酶的活性; ③ 3′→5′的外切酶活性; ④ RNaseH 的活性; ;DNA多聚酶 (Polymerase);DNA多聚酶 (Polymerase);DNA多聚酶 (Polymerase);DNA多聚酶 (Polymerase);DNA多聚酶 (Polymerase);DNA多聚酶 (Polymerase);核酸修饰酶;核酸修饰酶;基因克隆的策略和技术路线 ;载体应具备的条件 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）； 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点； 具有较高的外源DNA的装载能力； 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点； 具有合适的筛选标记；; 质粒(plasmid) 噬菌体(phage)和病毒载体 黏粒(cosmid) 噬菌粒(phagemid or phasmid) 酵母人工染色体(YAC) 细菌人工染色体(BAC);质粒 (plasmid);质粒 (plasmid);质粒 (plasmid);噬菌体 (phage);大肠杆菌的λ噬菌体;噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);噬菌体 (phage);? M13 DNA载体的构建;噬菌体 (phage); l-DNA载体和M13-DNA载体的装载量最大分别为25kb和2kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，在包装上限固定的条件下，只有大幅度缩短噬菌体DNA的长度，才能增加载体的装载能力。 将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，构建成黏粒（cosmid）或噬菌粒（phagemid）不仅能提高噬菌体DNA的装载量，也能像质粒一样导入大肠杆菌并进行筛选，兼具了质粒和噬菌体两者的优点。;黏粒 (cosmid);1978年，Collins和Hohn将1.8kb的λ-DNA片段与pBR322质粒片段组合在一起，所构建的载体装载范围为31- 45kb。;噬菌粒 (phagemid或phasmid);噬菌粒 (phagemid或phasmid);病毒DNA载体;逆转录病毒载体;逆转录病毒的基因组是一单链RNA分子，包裹在蛋白质外壳中。编码产物有外膜糖蛋白(env)、核心蛋白(gag)、逆转录酶(pol)等；非编码区有包装位点(ψ)、两端有长末端重复序列(LTR)等。 ;逆转录病毒基因组序列; 具有广泛的哺乳动物细胞宿主 能插入7kb或更大的外源基因