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荧光定量PCR技术的研究进展及其应用Development of Real-Time Polymerase Chain Reaction and Its Application 姓名： 学号： PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异DNA或DNA片段的方法，又称多聚酶链反应、无细胞克隆技术等。 包括：荧光定量PCR(FQ-PCR)、逆转录PCR (RT-PCR) 抗原捕获PCR (AC—PCR)、不对称PCR (Asymmetric PCR) 反向PCR (inverted PCR)、膜PCR (membrane-bound PCR) 彩色PCR (CCA-PCR)、原位逆转录PCR(In Situ RT-PCR) 间接原位PCR (Indirect In Situ PCR) 等 PCR技术概述 Real-time PCR技术:在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积，实时监测整个PCR反应过程，结合相应的软件可以对结果进行分析,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 一、荧光定量PCR原理 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Baseline 基线 Log－liner phase Log－liner phase 荧光基团 荧光检测元件 荧光定量PCR原理－－扩增曲线 荧光定量PCR原理－－扩增曲线 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Baseline Log－liner phase Log－liner phase 域值的定义： 将荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的荧光强度设定为域值。 Threshold 荧光定量PCR原理－－荧光域值 Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数 Cycle（循环数） Rn（荧光强度） Ct value 荧光定量PCR原理－－Ct值 Cycle number Ck 104 Ck 102 Sample Log of DNA concentration 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小。 Log模板起始浓度与Ct值呈线性关系。 荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系 二、荧光定量PCR技术的分类 目前荧光定量PCR技术所使用的荧光化学方法按照荧光产生原理可分为两大类，即 染料法 探针法 荧光定量PCR的分类－－染料法 染料法: 在常规PCR反应体系中加入 了染料分子。当反应体系中存在 dsDNA时，染料分子异性地掺入 dsDNA后发射荧光信号。 常用的染料: 溴化乙锭、YOYO、 YO -PRO、SYBR Gold、 SYBR Green I 与常规PCR的不同:在上、下游引物外还加入了具有序列特异性的探针(探针本身具有荧光标记)，该探针根据需要扩增的靶序列设计，因此只能与待检测序列结合，与染料法相比提高了实验的特异性。 TaqMan 探针法 分子信标 (MolecularBeacon) 杂交探针法 (hybridization probe) 荧光定量PCR的分类－－探针法 1 RNA的完整性---易降解 2 RNA样品中的基因组DNA污染---混有基因组DNA 3 反应体系的优化---保证扩增产物只有特异的目标产物 4 反转录---所得cDNA的量必须精确地等于相应的mRNA的量 三、荧光定量 PCR试验结果的因素 1.在植物病理学研究中的应用 植物病原菌检测中得到越来越广泛的应用 2.在肿瘤的诊断及相关基因表达研究上的应用 某些肿瘤的发生发展过程中表现为某个特定基因的高表达,通过荧光定量PCR可进行临床的早期诊断，从而及时调整治疗方案和评价疾病的预后。 四.荧光定量PCR技术的应用 3.在动物病毒病的检测中的应用 可用于动物病毒性疾病的快速诊断及定量检测，对某些烈性传染病病原体的诊断尤为安全。但由于仪器、试剂价格昂贵，限制了该技术的普及。 主要用于：新城疫(NDV)、鸡马立克氏病(MDV)、 禽流感(AIV)、鸭乙型肝炎(DHBV)、