毕业设计产绿原酸金银花内生菌的分离研究论文.doc

摘要 目的：通过对金银花不同组织器官内生真菌的分离，筛选能产生绿原酸的菌株，通过菌株的筛选及培养条件的优化，获得高产绿原酸的发酵菌株及培养基和培养条件。 方法：从金银花不同组织器官中分离内生真菌，通过分离纯化、发酵，对其发酵产物进行TLC和HPLC分析，同时利用显微观察法对其进行显微鉴定，对筛选的高产绿原酸菌株的发酵培养基和培养条件进行优化选择，并对菌株发酵液进行抑菌学实验。 结果：从金银花中分离筛选到三株纯化的的内生真菌，其浓缩发酵液与对照品有相同的迁移率，保留时间与对照品保留时间一致，结果表明，三株纯化获得的内生真菌能产生绿原酸，分别属于青霉属、毛霉属、曲霉属。经过发酵条件的优化，确定最佳发酵培养基为PDB培养基，培养条件为28℃,120r/min，震荡培养72小时。 结论：金银花不同器官中具有丰富的内生真菌，并有可能产生与宿主相同的活性成分绿原酸，纯化的产绿原酸菌株的发酵液具有明显的与金银花相同的抑菌效果。 [关键词]：金银花；内生真菌；绿原酸；发酵 缩写词表 TLC thin layer chromatography 薄层色谱 HPLC high performance liquid chromatography 高效液相色谱 PDA potato-dextrose-agar medium 马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDB potato-dextrose broth 马铃薯葡萄糖培养基 目录 1 前言 4 1.1 内生菌与植物的关系 4 1.2 内生菌天然药物新资源及其展望 5 2 问题的提出 6 3 材料与方法 7 3.1试剂 7 3.2 实验方法 8 3.2.1 菌株的筛选 8 3.2.1.1 实验材料的采集 8 3.2.1.2 样品的消毒处理 9 3.2.1.3 表面消毒效果的检测 9 3.2.1.4 分离与纯化 9 3.2.1.5 菌种的保藏 10 3.2.2 菌株次生代谢产物检测 10 3.2.2.1 菌株的小样培养 10 3.2.2.2内生菌发酵液的提取处理 10 3.2.2.3 薄层色谱法(TLC)检测绿原酸 11 3.2.2.4 高效液相色谱法(HPLC)检测绿原酸 11 3.2.3 内生真菌的形态学鉴定 11 3.2.4 二次发酵培养基的优化 12 3.2.4.1 固体基本培养基的选择 12 3.2.4.2 液体基本培养基的选择 12 3.2.4.3 发酵条件的单因素优化 13 3.2.4.4 发酵条件的正交试验 13 3.2.5 金银花内生真菌的抑菌实验 14 4 结果与分析 15 4.1 菌株筛选的结果 15 4.2 菌株次生代谢产物检测结果 15 4.2.1 薄层色谱法(TLC)检测 15 4.2.2 高效液相色谱法(HPLC)检测 16 4.3 内生真菌的形态学鉴定结果 19 4.3.1 传统鉴定方法 19 4.3.1.1 菌株形态学描述 19 4.3.1.2 显微形态鉴定 21 4.4 二次发酵条件的优化结果 25 4.4.1 固体基本培养基的选择结果 25 4.4.2 液体基本培养基的选择 25 4.4.3 纯化分离出的菌株发酵液形态 27 4.4.4 发酵条件的单因素比较 29 4.4.4.1 碳源的选择 30 4.4.4.2 氮源的选择 30 4.4.4.3 温度的选择 31 4.4.5发酵条件的正交试验 32 4.5 抑菌实验结果 34 5 结论与讨论 35 6 展望 36 参考文献 37 1 前言 1.1 内生菌与植物的关系 内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主植物表现出明显感染症状的微生物。内生菌也可理解为植物组织内的正常菌群，它们与植物的关系相当密切，是植物微生态系统的天然组成成分。关于内生菌的起源仍然有不同的观点，存在两种假说，即“内生说”和“外生说”:内生说认为内生菌与宿主植物应该具有相同或相似的遗传背景；外生说认为内生菌源于植物体外，通过植物体表、根际的自然孔口、伤口或诱导植物形成的通道进入体内。 内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中，植物以其内生菌的组织、细胞及其代谢产物为内环境，而内生菌以宿主植物的组织和细胞及其代谢产物为外环境，两者之间互相进行物质、能量及基因交流，在长期进化过程中与宿主协同进化，在演化过程中两者形成了互利共生的关系。一方面内生菌可从宿主中吸取营养供自己生长所需；另一方面，内生菌产生的次生代谢产物，能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对非生物胁迫（如抗干旱）和生物胁迫（如抵抗病虫害等）的抵抗能力，内生菌与宿主植物在长期协同进化过程中彼此构成了和谐稳定的生态关系。 另有观点认为内生菌与宿主植物间存在基因交流，对红豆杉，长春花等药用植物内生菌的研究中，