高效液相色谱操作步骤1.pptx

高效液相色谱 1.概述-发展 关于色谱分离方法的研究始于1901年，俄国植物学家 Tswett（茨维特）在研究植物叶子的组成时，用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散成三种颜色的6个色带。 两年后他发表了他的研究成果“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”，提出了应用吸附原理分离植物色素的新方法，在这一方法中把玻璃管叫做“色谱柱”，碳酸钙叫做“固定相”，石油醚叫做 “流动相”。三年后，他将这种方法命名为色谱法（Chromatography）。 色谱法于二十世纪五十年代之后飞速发展，并发展出一个独立的三级学科-色谱学。 1952年英国科学家阿切尔·马丁、理查德·辛格因发明了分配色谱法而共同获得诺贝尔化学奖，此外色谱分析方法还在12项获得诺贝尔化学奖的研究工作中起到关键作用。 1.概述-色谱分离的特点 应用范围广 复杂混合物，有机同系物，异构体，手性异构体。 气相色谱：沸点低于400℃的各种有机或无机试样的分析。 液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。 分离效率高 若用塔板理论数来表示色谱柱的效率，每米柱长可达几千至几十万的塔板数，特别适用于极复杂混合物的分离，且通常收率、产率、和纯度都较高。 操作模式多样 可通过选择不同的操作模式，以适应不同样品的分离。 灵敏度高 可以检测出μg.g-1(10-6)级甚至ng.g-1(10-9)级的物质量。 色谱分离的几个概念 所有的色谱分离操作均分为：装柱、上样、层析、洗脱。 其中的固定不动的相，称为固定相； 携带试样混合物流过此固定相的流体，称为流动相； 作为流动相的液体或气体，称为洗脱剂； 洗脱时从柱中流出的溶液，称为洗脱液； 加入洗脱剂使各组分分层的操作，叫层析，也叫展开。 分离原理 色谱过程的本质是待分离物质分子在固定相和流动相之间分配平衡的过程，不同的物质在两相之间的分配会不同，这使其随流动相运动速度各不相同，随着流动相的运动，混合物中的不同组分在固定相上相互分离。 不同组分在色谱分离过程中分离情况取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等的差异。 常用的固定相（色谱柱填料） 硅胶 活性炭 离子交换树脂 大孔吸附树脂 氧化铝 凝胶 纤维素衍生物 环糊精 聚丙烯酰胺 硅胶：应用广泛，适合各类成分 氧化铝：主要用于碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等 活性炭:用于水溶性氨基酸、糖类及苷类 聚酰胺：主用于酚类、醌类如黄酮类、蒽醌类及鞣质等成分 色谱分离法 吸附色谱 物理吸附：硅胶、氧化铝、活性炭为吸附剂进行的吸附色谱； 化学吸附：黄酮等酚酸性物质被氧化铝吸附、生物碱被酸性硅胶吸附等； 半化学吸附：聚酰胺与黄酮类、醌类等酚性化合物之间的氢键吸附，吸附力较弱，介于物理吸附与化学吸附之间。 常用的极性吸附剂：硅胶、氧化铝。 常用的非极性吸附剂：活性炭。 凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过色谱、排阻色谱） 原理：分子筛作用 葡聚糖凝胶（sephadex G） 羟丙基葡聚糖凝胶(sephadex LH-20) 凝胶过滤色谱 离子交换树脂法 原理：可交换离子与树脂上的交换基团进 行离子交换，并被吸附，用适当的溶剂 从柱上洗脱下来，实现物质的分离。 吸附规律 阳离子交换树脂—分离碱性成分 阴离子交换树脂—分离酸性成分 大孔吸附树脂 吸附性和分子筛原理相结合以苯乙烯为母体，二乙烯苯 为交联剂（非极性） 吸附力：范德华力或氢键 工艺流程：树脂预处理→树脂上柱→药液上柱→树脂的 解吸→树脂的清洗、再生。 分配色谱 原理：被分离成分在固定相和流动相之间的 分配系数不同。 正相分配色谱：流动相极性 固定相极性 反相分配色谱：流动相极性固定相极性 正相色谱：固定相为极性，流动相为非极性。 反相色谱：固定相为非极性，流动相为极性。用的最多，约占60～70％。 液相色谱类型 高效液相色谱仪的应用 1.环境污染物分析：大气、水、土壤和食品中的多环芳烃、多环联苯，阴离子表面活性剂，有机氯农药、有机磷农药，除草剂，酚类胺类，黄曲霉毒素等污染物的分离与鉴定。 2.精细化工：在精细化工生产中使用的具有较高分子量和较高沸点的有机化合物，如高碳数脂肪族或芳香族的醇、药物、燃料，工业产品的醛、酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各种表面活性物质的分离与测定。 3.食品、药品质量分析：药物残留，防腐剂、抗氧化剂、人工合成色素等食品添加剂的分离与测定，保健食品中的功效成分检测，真菌毒素分析等。 色谱柱简介 正相柱------固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。