M5SuperFastSeamless.docVIP

北京聚合美生物科技有限公司 Mei5 Biotechnology, Co., Ltd 北京市海淀区学院路甲5号768创意园B-1211 热线电话： （86）010M5 SuperFast Seamless Cloning Mix使用说明书 产品名称 单位 货号 M5 SuperFast Seamless Cloning Mix 20T(100ul) MF017-01 【储存条件】 长期保存，请置于-20?C，有效期6个月。使用后请及时放入-20?C保存以保证酶的活性。 【产品简介】 本产品不依赖于T4连接酶，不受载体和目的片段的酶切位点限制，而直接用重叠片段重组的方法，该试剂盒采用特殊的酶组合可以将任意方法线性化后的载体和与其两端具有16-25bp重叠区域的PCR片段定向重组连接，可以30分钟内实现A’粘性末端或者平末端PCR产物片段高效定向无缝克隆至载体的任意位点。 【产品特点】 1. 30分钟内可以将一个50bp-15kb PCR扩增片段（平末端、A末端均可）插入载体的任意位置。不受载体和插入片段酶切位点的可用性和平端/粘性末端的限制，可以在任意位点进行克隆。 2. 无缝克隆，插入点不会引入不需要的碱基序列。 3. 不依赖于连接酶及磷酸酶，克隆阳性率可达95%以上。 【原理示意】 线性化载体和插入DNA片段的制备： A、线性化载体的制备 1). 酶切来源：酶切所得线性载体，平末端或者粘端、单酶切或者双酶切均可，酶切后胶回收。 注意：一步法无缝克隆反应体系内无DNA连接酶，不会发生载体自连反应。因此，即使是以单酶切方式制备的线性化载体也无需进行末端脱磷酸处理。重组产物转化后出现的假阳性克隆 (无插入片段) 是由酶切不完全未线性化环状载体转化而形成的。我们推荐酶切后胶回收可以把这种未线性化载体比例降低到最低程度。 2). 反向PCR来源：建议使用高保真DNA聚合酶（X5系列高保真酶，货号MF003、MF005、MF007）制备，如果扩增条带单一可以通过PCR产物纯化或者胶回收（货号：MF029）获得载体。 注意：反向PCR的质粒模板也是非线性化载体，也可能导致假阳性克隆（无插入片段），因此PCR来源线性载体（PCR产物）纯化前用Dpn I内切酶消化质粒模板，可以降低背景，提???阳性率。但是一般情况下，经过胶回收已经足以把这种未线性化载体比例降低到最低，因此反向PCR来源的线性化载体我们也推荐胶回收。 B、插入DNA片段的制备 1). 一步法无缝克隆引物设计总的原则是：通过在引物5’ 端引入线性化克隆载体末端同源序列，使得插入片段扩增产物5’和3’最末端分别带有和线性化克隆载体两末端对应的完全一致的序列 (16 bp～20 bp)。 2). 插入片段引物设计：克隆引物包括插入片段特异性引物序列和重叠序列。 克隆正向引物（5-3)：线性载体正向≥16 nt重叠区序列(3’末端算起)+插入片段正向特异引物序列（18-25 nt） 克隆反向引物（5-3)：线性载体反向≥16 nt重叠区序列(3’末端算起)+插入片段反向特异引物序列（18-25 nt） 注意：重叠区的碱基数至少16 bp，并且Tm值需要﹥48°C (AT pair = 2°C and GC pair = 4°C)，否则可延长碱基数目直到符合要求。 按照线性载体末端的结构（5’突出，3’突出，平末端），引物设计也分3种情况，示意如下： 线性化载体的两端因线性方式（如单酶切、双酶切、反向PCR）不同，可以是以上三种末端结构的两两任意组合，插入片段特异性引物设计的原则遵循一般引物设计的原则即可。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。 3). 酶的选择：建议使用高保真DNA聚合酶（X5系列高保真酶，货号MF003、MF005、MF007）。 4). 反应条件：一般按照具体使用的高保真聚合酶说明书进行即可。 5). 纯化插入片段（视如下几种情况选择回收方法）： ? a）片段来源于质粒模板，且该质粒与重组载体具有相同抗性，纯化前用Dpn I内切酶消化质粒模板， 可降低背景提高阳性率。 ? b）片段来自PCR产物，且PCR结果单一，则建议用PCR产物纯化试剂盒（货号：MF029）纯化片段。 ? c）PCR有非特异扩增，则建议切胶回收，用胶回收试剂盒（货号：MF029)回收片段。 注意：使用该方法克隆，用来线性化载体的酶切位点在拼接的时候会缺失，如