免疫实验报告-王鹏.doc

成绩： 北京农学院研究生课程论文 高级免疫学课程实验 学生姓名 王鹏 学 号 201030311009 系 别 动物科学技术学院 专 业 基础兽医学 任课教师 李焕荣副教授 2011年06月01日 多克隆抗体的制备、蛋白质粗提及鉴定 实验一 多克隆抗体的制备 一 实验目的 1．加深对抗体基本知识的了解。 ⒉ 了解多克隆抗体的制备方法。 二 实验原理 1.抗原注入家兔体内后，由于是外源大分子物质，将充当抗原刺激免疫系统，由B细胞产生多克隆抗体。在实验中，抗原的纯度越高，越有利于实验。如果抗原同免疫佐剂一同注入，佐剂将加强抗原的刺激效果，使家兔表达更多的抗体，其血清中的抗体浓度也会明显升高。佐剂分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂，本次实验采用弗氏不完全佐剂，由羊毛脂与液体石蜡以1：1混合，再与抗原溶液以1：1混合，研磨后形成“油包水”剂，抗原浓度为1mg/ml，每次注入1ml。佐剂组与非佐剂组血清抗体效价的差别可以用ELISA检出。 2.双向免疫扩散实验原理 可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质的琼脂凝胶层中从两个孔中向四周扩散，若两者分子比例适当，则在扩散的一定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀线。观察该白线出现的最大稀释倍数即是抗体的效价。 3.ELISA原理（免疫酶链反应吸附实验） 该技术属于免疫酶技术。酶免疫技术是利用抗原抗体反应的高度特异性和酶对底物高效催化性，将抗原或抗体吸附于固相载体表面，通过底物的显色反应鉴定抗原抗体结合的反应 。ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原 或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。 4、抗原和抗体在体内外均可以发生特异性结合，在体外特异性结合后可出现用肉眼或仪器鉴定的现象，并根据结果对样品中的抗原或抗体能进行定性、定量、定位的检测。在进行抗原抗体反应时，多采用人或动物的血清作为抗体来源。 蛋白质抗原一般要求相对分子质量约在10000以上。一般而言，相对分子质量越大，结构越复杂，免疫原性越强。BSA??分子量约为67kDa，本实验以它为载体，与半抗原Hb和Dx偶联，可作为抗原刺激机体产生免疫应答。为获得高质量的免疫血清通常使用免疫佐剂，它可增强抗原的免疫原型，延长其在体内的存留时间，使初次反应和二次反应融合在一起，使机体的抗体水平持续上升达到理想效果。 三 实验材料 1 实验动物 12周龄家兔（2.0kg左右） 2 主要仪器 高速低温离心机 酶标仪 3试剂 弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂 HRP标记羊抗兔二抗 1%明胶 免疫原（Hb-BSA、Dx-BSA）、包被原（Hb-OVA、Dx-OVA）。 4 主要溶液配制 包被液（0.05 mol/L pH 9.6的碳酸盐缓冲液）：准确称取Na2CO3 1.59 g ,NaHCO3 2.93 g，溶于950 mL的蒸馏水中，调pH值为9.6，定容到1 L。 0.01 mol/L PBS（pH 7.4）: NaCl 8 g KH2PO4 0.2 g Na2HPO4（无水） 2.13 g KCl 0.2 g 37℃加热溶解后，定容至1000 mL，121℃高压灭菌。 洗涤液（0.01 mol/L pH 7.4的PBST溶液）：1 L PBS中加入0.5 mL Tween-20。 封闭液（血清稀释液）：于PBST中加入明胶至终浓度为1%。 终止液（2 mol/L H2SO4）：分别取蒸馏水177.8 mL和浓硫酸22.2 mL混和即可。 0.1mol/l pH6.0磷酸盐缓冲液（PB）：称取Na2HPO4·2H2O 1.09g, NaH2PO4·H2O 6.05g,蒸馏水溶解后定容至500ml，4℃贮存备用。 TMB贮液:称取TMB10mg,溶于10ml二甲基亚砜中，4℃避光贮存备用。 TMB应用液（底物）:1ml的0.1mol/l pH6.0磷酸盐缓冲液，100?l的TMB贮液加15.l的30%H2O2，先用现配。 饱和硫酸铵（SAS）：查硫酸铵饱和度表，配置不同饱和度的硫酸铵，热至50～60℃保温数分钟，趁热滤去沉淀，再在0℃或25℃下平衡1～2天。 四 试验步骤 1针对Hb-BSA和Dx-OVA的多克隆抗体的制备 5周龄大耳白兔，Hb-BSA和Hb-BSA分别用无菌生理盐水配成2mg/ml溶液。取上述溶液和等量的福氏完全佐剂混合并充分乳化后作为免疫抗原，试验组每只每次注射1ml乳化好的抗原，首次颈背部多点皮内免疫。第二次以BSA溶液和等量福氏