黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响.doc

黄芩苷对小鼠哮喘模型的炎性细胞的影响 试验设计 试验材料： 试验动物：健康BALB/c小鼠60只，雌性，6-8周龄，体重18-22g。小鼠随机分成6组：正常对照组、模型组、地塞米松阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组。 试验试剂：黄芩苷、卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶、地塞米松、小鼠TL-4、IL-5、. 1L-13、IL-17、IFN-γ细胞因子和小鼠抗OVA-IgE ELISA试剂盒、脂多糖（LPS）、过碘酸—雪夫反应试剂盒、RT-PCR试剂盒、乙酰甲胆碱等 主要仪器： 试验方法： 建模： ① 嗜酸性粒细胞性哮喘模型 模型组、阳性对照组及黄芩苷高、中、低剂量组小鼠分别于第1、7、15天腹腔注射OVA溶液0.2mL(含OVA20μｇ、氢氧化铝1ｍｇ),于实验第21天起将小鼠置于密闭容器内,予2%OVA生理盐水雾化激发,1次/天,每次30min,连续7ｄ,以呼吸急促深快、烦躁呛咳及点头运动等症状的出现为激发成功;正常对照组:于第1、7、15天以生理盐水代替OVA溶液给小鼠腹腔注射(0.2ｍＬ),第21天起以生理盐水进行雾化激发。其余同前。 ② 中性粒细胞性哮喘模型 小鼠致敏：于实验第1天、7天和15天分别致敏，共三次。方法：每只小鼠用 1%戊巴比妥钠溶液 50mg/kg 腹腔内注射麻醉后，使其颈部竖直，用移液器取 10μg LPS 经鼻逐滴滴入，利用小鼠呼吸将致敏液吸入气道，左右鼻孔交替进行并于腹腔内注入 OVA 50μg。 小鼠激发：从实验第 21 天起，将哮喘组小鼠置于自制小鼠雾化吸入箱中，用 5%OVA溶液进行雾化吸入激发，每天雾化 30min，连续雾化2周 给药方法：自实验第21天起,在OVA溶液雾化攻击前1ｈ给予相应药物。黄芩苷高、中、低剂量组分别灌胃给予黄芩苷90、30、10mg/kg (灌胃容积25ml/kg);阳性对照组小鼠灌胃给予地塞米松1.0mg/kg;正常对照组、模型组小鼠灌胃等容积生理盐水,连续7ｄ(于第28天,即末次激发后24ｈ处死小鼠)。 标本收集： 小鼠血清：末次激发后24 h,小鼠经眼球采血。全血37℃静置2 h,4℃过夜,3 000 rpm离心l0min。收集血清样本,用于测定血清中抗OVA特异性IgE表达水平。 肺泡支气管灌洗液：末次激发后24 h,将小鼠麻醉腹部向上固定于蛙板,剪开皮肤,剥离气管,用眼科剪将气管剪适中小口,用磨平的15号针头做气管插管,将线绳穿过气管底部,固定气管与针头。将0.5mL37℃生理盐水缓慢注入其中,轻轻按压胸部,然后回收置于离心管中,重复2次,使其回收率达80%。合并3次灌洗液。 BALF中细胞因子测定：将 BALF 1 500 rpm 离心10 min,取上清液测定BALF中 IL-4、IL-5 、IL-13、IL-17、IFN-γ表达水平。按ELISA试剂盒说明书进行测定。 BALF中炎性细胞总数和分类计数：将BALF离心后细胞泥悬浮于1mL PBS,吸取20μL涂片、干燥、固定,进行瑞士-姬姆萨染色,每板至少200个细胞。根据形态学特征进行分类计数,炎性细胞总数、嗜酸性粒细胞(EOS)、中性粒细胞（NEU）和巨噬细胞。 肺病理组织切片的制作:末次激发后24 h,小鼠眼球放血处死,剪 小鼠皮肤,剖开胸腔,取出肺脏。将小鼠肺脏浸入10%福尔马林固定,修整组织块,常规石蜡包埋切片,进行HE染色,镜检观察。过碘酸雪夫氏(AB-PAS)染色观察黄芩苷作用后,哮喘模型小鼠肺部病理学变化。 RT-PCR: 引物设计及合成　Ｔ-ｂｅｔ,上游,5′-ＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＧＣＴＴＡＴＡＴＧ-3′,下游,5′-ＧＡＣＧＡＴＣＡＴＣＴＧＧＧＴＣＡＣＡＴＴＧＴ-3′,扩增产物136ｂｐ;ＧＡＴＡ-3,5′-ＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＣＧＣＴＡＡＴＧＧ-3′,下游,5′-ＧＡＡＣＴＣＴＴＣＧＣＡＣＡＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＣ-3′,扩增产物408ｂｐ;ＳＴＡＴ-6,上游,5′-ＣＡＣＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＡＴ-3′,下游,5′-ＣＴＧＡＡＴＣＣＴＴＡＡＣＡＧＡＡＣＣ-3′,扩增产物361ｂｐ;β-ａｃｔｉｎ,上游,5′-ＡＴＧＴＴＴＧＡＧＡＣＣＴＴＣＡＡＣＡＣ-3′,下游,5′-ＣＡＣＧＴＣＡＣＡＣＴＴＣＡＴＧＡＴＧＧ-3′,扩增产物491ｂｐ。 趋化因子：Th1：CXCR3、CCR5 Th2：CCR3、CCR4、CCR8 气道阻力、AHR测定:于雾化第1、7、14天釆用Buxco小鼠肺功能仪(Fine PointeTM SeriesRC Site)检测小鼠总气道阻力。l%OVA雾化完毕后立即予1%戊巴比妥钠60mg/kg麻醉小鼠,切开皮肤,钝性分离皮下组织、肌肉,充分暴露气管,眼科剪剪开一个小口,取18G Buxco小鼠气管插管置入气管中行有创气