3菌种选育.ppt

菌种退化变异的原因 遗传基因型的分离 自发变异的产生 用沙土管等长期保藏 菌种连续传代 活细胞内进行的新陈代谢 DNA中存在的增变基因、死亡基因等引起基因突变 诱变剂处理后的退化变异 初筛菌落不纯 诱变菌种是异核体细胞 诱变菌种的DNA发生缺失、整合和重排 纯种筛选的选择性标记 排除低产型菌落 低产型菌落的特征 光秃型，不产气生菌丝。 生长势衰退，菌落长得过小。 菌落表面、孢子生长和颜色等不均匀。 生长过于旺盛。 高产型菌落的特征 孢子生长有减弱趋势。 菌落大小适中，有偏小趋势，但不是极小。 菌落偏小，但孢子生长丰满。 孢子颜色有减弱的趋势。 沟纹多、密、直而整齐。 营养菌丝分泌色素或逐渐加深，或逐渐变浅。 摇瓶筛选高产型菌株 遗传基因型纯度考察 传代稳定性试验 抗生素作为诱变剂用于菌种选育 b-内酰胺抗生素：抑制细胞壁的合成 多烯类抗生素（制霉菌素、两性霉素B）：作用于细胞膜的Na+－K+－ATP酶、磷酸转移酶等，损伤含有麦角甾醇等的真菌细胞膜而造成细胞内含物向外泄漏。Eg 制霉菌素处理产黄青霉获得高产青霉素。 大环内酯和氨基环醇类抗生素：抑制mRNA聚合酶、氨酰tRNA合成酶、肽酰基转移酶和各种蛋白质因子的活性来抑制蛋白质合成，从而干扰生物体的正常复制 抗肿瘤抗生素：使微生物菌种的细胞壁、细胞质膜、核酸和蛋白质的生物合成系统发生变化而得到突变株。E.g. 丝裂霉素C处理春日霉素产生菌获得高产突变株。 诱变处理过程中的几个有关问题 诱变剂 诱变剂的选择：各种诱变剂交替使用。 诱变剂量的选择：75～99.9％致死率。 增变剂的选择： 氯化锂 孢子萌发 增强uv的诱变效果。 8-甲氧基补骨脂素＋长波紫外线，吸收其能量而与DNA分子中胸腺嘧啶结合。获得麦白霉素高产菌株。 影响诱变效果的因素 出发菌株的选择：纯、稳定 对菌种生理特性的要求： 新鲜培养的斜面孢子、预萌发的孢子 单孢子悬浮液 诱变处理时的外部条件： UV：避光 NTG:不能用pH中性的buffer 碱基类似物：合成培养基添加碱基类似物 * * 微生物突变类型 病原产生能力、表面抗原等 病原性变异 耐药性、对自身代谢产物抗性、噬菌体抗性、对紫外线及其他辐射因子的抗性等 抗性变异 糖类分解能力、色素产生能力、有关酶的活性、营养要求和性质、温度敏感性、代谢产物生产能力 生理生化变异 细胞膜、孢子的表面结构及抗原构造 细胞结构 鞭毛、夹膜、菌丝形状、生长速度、分枝多少及形状、孢子大小和形状、产孢子器官形状 细胞形态 菌落大小、形态、表面结构、颜色、产孢子多寡或有无 菌落形态 形 态 变 异 变 异 性 状 变 异 类 型 遗传变异类型 自然分离 补骨脂素与DNA中碱基的作用 高单位菌种选育方法的进阶 筛选带有抗生素抗性基因或其他遗传标记的转化子 生物合成基因、抗性基因、启动于等DNA的转化 理性化筛选 去代谢物调节突变株的筛选 耐前体及其类似物突变抹的筛选 耐自身产物及其类似物突变株的筛选 耐金属离子突变株的筛选 耐分解阻遏物突变株的筛选 耐磷酸盐突变株的筛选 形态突变株的筛选 膜渗透性突变株的筛选 代谢途径障碍突变株的筛选 抗生素酶缺失突变株的筛选 抗次级代谢产物生物合成酶抑制剂突变株的筛选 初级代谢酶高活力突变株的筛选 适应酶系统调节突变株的筛选 紫外线、亚硝基胍、原生质体再生、融合等 半理性化筛选 直接摇瓶筛选 琼脂块预筛选 自动化筛选 紫外线（UV）、 亚硝基胍（NTG） 随机 筛选 筛选方案的设计 处理方法 方法 琼脂块筛选方法 第一轮：一个出发菌株 200个单菌落 初筛 每株1瓶 复筛 每株3~5瓶 5株 第二轮： 5个菌株 诱变剂 处理 5 X 40株 初筛 每株1瓶 50株 复筛 每株3~5瓶 5株 第三、第四轮：同第二轮 诱变剂 处理 50株 摇瓶筛选流程1 摇瓶筛选流程2 第一轮：一个出发菌株 诱变剂 处理 200个单菌落 初筛 每株1瓶 20～30株 复筛 每株3瓶 2~3株 3株菌株 自然 分离 3 X 50株 初筛 每株1瓶 20～30株 20～30株 复筛 每株3瓶 2~3株 第二轮：重复第一轮 发酵过程中所用的一些前体物质 产黄青霉 产黄青霉 生金链霉菌 灰黄链霉菌 红霉素链霉菌 保加利亚乳酸杆菌 丙酸杆菌 布拉氏须霉 枯草芽孢杆菌 粘质赛氏杆菌 Hansenula anomala glycinophilam棒状杆菌 青霉素G 青霉素V 金霉素 灰黄霉素 红霉素 核黄素 维生素B12 类胡萝卜素 L-异亮氨酸 L-异亮氨酸 L-色氨酸 L-丝氨酸 苯乙酸及其类似物 苯氧乙酸 氮 氯 正丙醇 丙酸盐 氰化物 ?-紫罗酮 ?-氨基丁酸 D-苏氨酸 邻氨基苯甲酸 甘氨酸 产 生 菌 产 物 前 体