dna修饰和其检测技术.pptx

第四节：DNA修饰 DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG岛的CpG二核苷酸的胞嘧啶5‘碳位共价键结合一个甲基基团。 作用： 是哺乳动物基因表达调控的主要形式。 DNA甲基化特点： 可遗传的，即这类改变通过有丝分裂或减数分裂能在细胞或个体世代间遗传； 是基因表达的改变; 没有DNA序列的变化，或不能用DNA序列变化来解释。 CpG岛（CpG Island） CpG岛（CpG Island）： 成簇的CpG二联体被称为“CpG岛” CpG岛的结构特征： 一般以1－2kb的DNA长度范围内，（G＋C）含量超过60％（正常的为20％），并有高浓度的CpG二核苷酸，高出平均水平10～20倍。 CG岛通常是一些稀有的内切酶的切点，如果基因组中这种限制位点的紧密成簇，则表明含有CG岛，然后进行Southern印迹可鉴定基因。 人基因组内有45000个CpG岛，其中16000个在Alu序列中，还存在29000个CpG岛; 组成型表达的基因中100％含有CpG，在组织特异性表达的基因中40％有CpG。 没有甲基化的C极易变成U而被修复，甲基化C脱氨基后形成T，因此CpG序列容易丢失。 在两个CpG岛之间有8－10碱基的重复序列，该序列决定了甲基化发生的地点。 DNA甲基化的作用 CpG占基因组的10％，其中70－80％为甲基化。 未甲基化的CpG岛处于组成性表达基因启动子的周围；也存在于一些组织特异性基因的启动子周围 CpG岛的甲基化改变了染色质结构，造成高度螺旋化，失去了DNase敏感性，阻止了启动子的活化，同时能够与甲基化CpG结合蛋白质结合，如组蛋白去乙酰化酶等，可以抑制基因的表达。 甲基化DNA 可直接作用于甲基化敏感转录因子E2F、CREB、A P2、NF2KB、Cmyb、Ets使其失去结合DNA的功能，阻断转录 甲基化CPG 粘附分子可作用于甲基化非敏感转录因子(SP1、CTF、YY1) , 使它们失活, 从而阻断转录。5 种带有甲基化DNA 结合域(MBD ) 的甲基化CpG 粘附蛋白(MECP2、MBD1、MBD2、MBD3；MBD1 )有糖基转移酶活性, 可将T 从错配碱基对T－G 中移去。 用组蛋白Hl与含CCGG序列的甲基化和非甲基化DNA实验后发现： 甲基化达到一定程度时会发生从常规的B-DNA向Z-DNA的过渡。又由于Z-DNA结构收缩，螺旋加深，使许多蛋白质因子赖以结合的元件缩入大沟而不利于基因转录的起始。 DNA甲基化导致某些区域DNA构象变化，影响蛋白质与DNA的相互作用；抑制转录因子与启动区DNA的结合效率。 用序列相同但甲基化水平不同的DNA为材料，比较其作为RNA聚合酶转录模板的活性，发现甲基的引入不利于模板与RNA聚合酶的结合，降低了其体外转录活性。 5-甲基胞嘧啶在DNA上并不是随机分布的，基因的5端和3’端往往富含甲基化位点，而启动区DNA分子上的甲基化密度与基因转录受抑制的程度密切相关. 组织培养的细胞由于甲基化作用，使细胞系不能表达出相应的组织特异性蛋白质。 2006年制备了拟南芥的全基因组甲基化图谱，发现转录区域1/3以上的表达区域出现了甲基化；而启动子区有少于5％的基因出现了甲基化；在转录区域的甲基化表现出了明显的组织特异性。 甲基化通常发生于外源序列中，使其处于异染色质状态，是寄主抵御外源序列入侵的策略，是1种主动防御机制。 DNA甲基化形成过程 在DNA甲基化过程中，胞嘧啶DNA双螺旋突出进入与酶结合部位的裂隙，通过胞嘧啶甲基转移酶把活性甲基从甲硫氨酸转移至5’胞嘧啶位上，形成5’甲基胞嘧啶。 2类甲基转移酶： 维持甲基化的DNA甲基转移酶Dnmtl： 使复制后形成的半甲基化DNA进行全甲基化；获得与亲本DNA完全相同的甲基化形式。 S期：Dnmt1与其相关蛋白DMAP1共同定位于复制叉处 重新甲基化的DNA 甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3b： 在没有甲基化的DNA双链上进行甲基化 在不同的细胞周期其位置会发生改变，如小鼠成纤维细胞中Dnmt3a、异染色质蛋白HP1以及甲基化DNA结合蛋白MeCP2都定位于复制晚期的异染色质着丝粒周围，而Dnmt3b则普遍存在于核内； 在胚胎干细胞中，Dnmt3a、Dnmt3b和HP1则都定位于着丝粒周围。 CpG甲基化形成机制： 甲基化酶： Dam甲基化酶：催化GATC中的A甲基化（原核） Dcm甲基化酶：催化CCGG中2位C甲基化（原核，JM109,HB101） 真核生物甲基化酶：CpG的C形成5‘－甲基胞嘧啶 维持甲基化酶（maintenance DNA methyltransferase) (dnmt1) :在甲基化双链中只有亲代是甲基化的，而子代为非甲基化。此酶识别亲代甲基化位点，催化子代甲基化；对半甲基化的全甲基