2.荧光光度法测定维生素B2的含量.docx

实验五 荧光光度法测定维生素B2的含量 一、实验目的 1、学习荧光分光光度法测定维生素B2的分析原理； 2、掌握荧光分光光度计的操作技术和测定维生素B2的方法。 二、实验原理 1.荧光光度法原理 （1）常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 （2）荧光分析法的特点： a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 （3）荧光光谱 激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线。 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 （4）荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示： I0 液槽 显示器 单色器 检测器 I0 I If 光源 单色器 2. 荧光光度法测定多维葡萄糖粉中维生素B2的含量 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。维生素B2溶液在430～440 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535 nm。维生素B2在pH=6～7的溶液中荧光强度最大，在pH=11的碱性溶液中荧光消失，所以可以用荧光光度法测维生素B2的含量。 多维葡萄糖中含有维生素B1、B2、C、D2及葡萄糖，其中维生素C和葡萄糖在水溶液中不发???光，维生素B1本身无荧光，在碱性溶液中用铁氰化钾氧化后才产生荧光，维生素D2用二氯乙酸处理后才有荧光，他们都不干扰维生素B2的测定。 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 三、试剂与仪器 仪器：970CRT荧光光度计，5 ml吸量管1只，2 ml吸量管1只， 50 ml容量瓶6只, 100 ml容量瓶1只， 试剂：10.0μg/ml（实际浓度请自己记录）维生素B2标准溶液，冰乙酸，试样若干 四、实验步骤 970CRT荧光光度计的基本操作 1. 先打开氙灯，再打开主机，然后打开计算机电源，荧光光度计工作站自动启动并初始化仪器，预热20—30min 2. 仪器初始化完毕后，在工作界面上选择测量项目，设置适当的仪器参数例如：设置激发波长为440nm，发射波长为330 nm，灵敏度＝2，入射缝宽和出射缝宽均为10nm。 3. 样品测定 (1)标准系列溶液的配制及标准溶液荧光强度的测定： ? 在6个干净的50 ml容量瓶中，分别吸取0.50、1.00、1.50，2.00，2.50和3.00维生素B2标准溶液，各加入2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。得到不同浓度的溶液分别是：0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6ug/ml的维生素B2溶液，从稀到浓测量系列标准溶液的荧光强度。 (2)未知试样的测定: 准确称取一片维生素B2片,用研钵研细，加少量水溶解后（不得超过定容体积），将其全部转入50 ml比色管中，于超声振荡器中超声溶解后，定容。 将超声分解后的样品试液经0.45μm膜过滤后,准确取滤液适量置于50 ml比色管中，加2.00 ml冰乙酸，稀释至刻度，摇匀。用测定标准系列时相同的条件，平行测量其荧光强度3次。 （黑体字部分实验报告中请按自己实际操作撰写） 4.定性实验：改变狭缝宽度、灵敏度、扫描速度，记录发射光谱曲线，进行实验条件的讨论。 5. 退出主程序，关闭计算机，先关主机，最后关氙灯。 ? 五、实验结果及数据处理 1. 用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 2．根据待测液的荧光强度，从标准工作曲线上求得其浓度，计算出试样中含量。 六、思考题 1. 试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因? 2. 维生素B2在pH＝6～7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？ 3. 如何绘制激发光谱和荧光发射光谱? 五．实验结果及数据处理 1用标准系列溶液的荧光强度绘制标准工作曲线 表一 CB2/μg/ml0