反向遗传操作技术.pdf

生物秀实验频道——努力做您的实验助手！? /bio101/? 反反向 向遗 遗传 传操 操作作 技 技术 术 生物 秀 搜 集 整 理 ww w . b b i o o . c o m 反向遗传操作技术(? reverse? genetics)与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思 路相反，是指通过构建?RNA 病毒的感染性分子克隆，在病毒?cDNA? 分子水平上对其进行体 外人工操作，也被称为“病毒拯救(?the?rescue?of? virus)?”。 反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质 来研究生命的发生与发展规律。反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通 过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成 顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基 因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。与 之相关的研究技术称为反向遗传学技术。? RNA 病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病 毒或类似病毒物质。能 够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个 病毒基因组的?cDNA?拷贝,使得?cDNA?本身或从?cDNA?体外转录所得的?RNA?具有感染性。? RNA? 病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表 型,可以在体内(in?vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。自?1978 年 第一例?RNA?病毒?Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类?RNA?病毒的分子生物学研究取得了长足 的进展,这主要归功于各种?RNA 病毒反向遗传系统的建立和发展。该技术的核心是首先构建? RNA?病毒的全长?cDNA 分子，并使之受控于?RNA?聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得 到病毒?RNA，然后将该转录物?RAN?转染哺乳动物细胞可拯救到???病毒，由于这种拯救病毒 是来自全长?cDNA?分子,因此可以在?DNA?水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通 过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制,病 毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新型的疫苗。目前已有 许多?RNA 病毒的全长感染性?cDNA 克隆构建成功。 俺就是搞流感病毒的反向遗传的，而且， 现在搞得 非常的溜，拯救的 成功率是?90%以上。 先贴上我的论文中对此领域的背景介绍：? The?earliest?reverse?genetics?techniques?for?negative?stranded?RNA?viruses?were? developed?only?for?influenza?A?virus?in?deed?(Enami?et?al.,?1990??Luytjes?et?al.,? 1989).? But? for? a? long? time,? the? fundamental? research? of? this? virus? has? been? hampered?by? the? lack?of?the?efficient?reverse?genetics?systems.?The?rescue?of 中国生物科学论坛【生物秀论坛】? 1? /bbs/? 生物秀实验频道——努力做您的实验助手！? /bio101/? influenza? virus? entirely? from? cDNA? was? finished? in? 1999? (Fordor? et? al.,? 1999?? Neumann?et?al.