凝胶柱层析资料.ppt

实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶;一、目的要求;二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、分子排阻层析，是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。;内水体积Vi 外水体积Vo 柱床体积Vt 洗脱体积Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi;Kd=0 Kd=1 0Kd1 Kd1; 优点： 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 ;凝胶的类型： Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛 Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶;凝胶及柱的选择 ;凝胶的处理及装柱 凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡 装柱时要注意操作压。;装柱的两种方法： a.手工操作 1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加入凝胶 b.电动搅拌下的装柱法 （如图4-9） ;样品上柱 分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的10—20% 洗脱收集 部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法 0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰 ;应用 a. 分离蛋白质 b. 脱盐 c. 蛋白质分子量的测定;三、仪器的使用－核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法 ;核酸蛋白检测仪及记录仪操作方法;5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为“0”厂家巳调好，光密度A要调零，量程开关拔到100％T，调节光量旋钮，使记录仪指针在10mV数字显示为100，即透光率为100%。把量程开关拔到“A”挡，缓慢调节A调零旋钮，使检测仪数字显示为“0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在0位 。 6、上述5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。 7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。 ;记录仪光吸收A读数 当采用l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于A量程开关所对应的A读数范围。如A量程开关选定在0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收A读数为0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度)位置时即为0.25A。 数字显示光吸收A读数(可变量程读数模式) 当A量程开关选定在0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收A的实际读数，如显示为080即表示为0.80A。 当A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为: A量程选定在0-2.0档时，数显读数×2=实际光吸收读数A A量程选定在0-1.0档肘，数显读数×1=实际光吸收读数A;部分收集器的操作方法;2．定位， 将“顺/逆”键置于“顺”或“逆”状态，按“手动”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将“顺/逆”键置于“逆”或 “顺”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管(在 “顺”状态，第一臂试臂为最外的那根。在“逆”状态，第一臂试管为最内的那根)。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。 ;四、操作方法;（二）装柱 1.装柱前，可以用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出（此步不做）。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约5cm高度柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速（0.5 mL/min）左右，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。 （三）凝胶柱的平衡 通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 ;（四）加样 1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪。柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。核酸蛋白检测仪的量程置于2A，记录仪量程置于10mV，走纸速度设定0.5 mm/min。 2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将碱性磷酸酶样品溶液2mL小心加到凝胶床面上，应避免将柱床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁2次。最后凝胶上方加满洗脱液，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通洗脱瓶。上样和洗脱的流速为0.3mL/min左右。 （五）洗脱 洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.01mol/LTri