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用于检测和定量分析极性细胞代谢物的一种新颖的HILIC LC-MS方法 来源：沃特世公司 阅读数:61 时间：2011-04-20 引言 复杂生物样品通常包含大量可反映有机体代谢状态的内源性代谢物。特别是骨骼肌可根据其是快收缩肌（白色肌肉，糖酵解型）还是慢收缩肌（红色肌肉，氧化型）而表现出特征性的代谢组“指纹图谱”。例如，红色肌肉应显示一种富含线粒体代谢物（如三羧酸循环）的代谢组指纹图谱；而白色肌肉应显示富含糖酵解代谢物的代谢组指纹图谱，其线粒体代谢物的浓度大大低于红色肌肉。虽然很多这类代谢物可具有较强的极性，但这些样本通常使用反相液相色谱-质谱（RP-LC-MS）进行分析，由此而来的多是较差的保留。在本研究中，我们开发了一种用于检测和定量强极性细胞代谢物的新颖LC-MS方法。本研究采用了基于亚2微米颗粒BEH酰胺柱的亲水作用液相色谱（HILIC），并联用了杂化四极杆飞行???间质谱仪和三重四极杆质谱。 方法 这些试验借助联用了沃特世SynaptTM HDMSTM、沃特世Synapt G2 HDMS和Xevo TQ的一台UPLC系统而进行： 液相色谱条件（1）：使用碱性流动相 液相色谱系统：沃特世ACQUITY UPLC?系统 － 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm － 柱温：45℃ － 流速：500μL／分钟 － 碱性流动相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸铵，pH=9.0 － 碱性流动相B：乙腈／水，50/50（v/v），10mM醋酸铵，pH=9.0 － 梯度（采用碱性流动相进行分离时）：线性梯度，先用2% B - 85% B洗脱8分钟，然后在98% B的水平下保持2分钟，接着返回到2% B的水平进行再平衡（5分钟） － 进样量：5-20μL 液相色谱条件（2）：使用酸性流动相 液相色谱系统：沃特世?ACQUITY UPLC?系统 － 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 酰胺基柱，2.1×100mm，1.7μm － 柱温：40℃ － 流速：600μL／分钟 － 酸性流动相A：乙腈／水，95/5（v/v），10mM醋酸铵，pH=3.0 － 酸性流动相B：水，10mM醋酸铵，pH=3.0 － 梯度：先用5% B - 30% B洗脱5分钟，在第5.5min时升至60% B并保持7分钟，接着返回到5% B的水平进行再平衡（5分钟） － 进样量：20μL满定量环 质谱分析 Synapt HDMS和Synapt G2 HDMS 该质谱仪在正离子MSE模式下运行。所用的毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设定为120℃和400℃。 在MSE采集模式下，仪器交替在低、高碰撞能量状态下进行交替扫描。这样可在一次分析内同时收集所有分析物的母离子和碎片离子的信息，消除了诸如DDA等其它常规方法所带来的采样偏差；在常规方法中，特定的m/z必须在碎片化前被分离出来。 Xevo-TQ质谱 Xevo TQ可同时在正离子和负离子模式下运行。毛细管电压为3.0kV，源温度和去溶剂化温度分别被设定为150℃和650℃。去溶剂化气体流速被设定为1200L／小时，碰撞气体（氩）的流速为0.18mL／分钟（4×10-3毫巴）。MS1/MS2分辨率被设置为单位质量（0.75Da FWHM）。 组织提取物的样品制备 红色的比目鱼肌（S）用来与白色的腓肠肌（G）进行比较，肌肉从禁食一整夜的BALB/c小鼠中切下并进行了急速冷冻。代谢物通过组织均质化的方法在1:1的甲醇：水混合溶剂中进行萃取，脂质通过将氯仿以1:1的比例添加至甲醇／水萃取液中而得到去除。去脂质后的组织萃取样本分别用400μL和4000μL的90:10乙腈：水混合溶剂进行挥干复溶。由于某些组分的含量高于定量上限，因此也对每份样本再稀释10倍进行了分析。 结果和讨论 1. 通过联用Synapt HDMS的UPLC进行HILIC LC-MS方法开发 图1. 108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图，其中包括氨基酸、DNA/RNA碱基及其磷酸盐、辅酶A、B族维生素、有机酸等。 图1给出了108种标准强极性细胞代谢物的总离子色谱图（TIC），其中包括氨基酸、DNA/RNA碱基及其磷酸盐、辅酶A、B族维生素、有机酸等。此项试验通过联用沃特世Synapt HDMS（正离子MSE模式下）的沃特世UPLC【液相色谱条件（1）】而进行。 2. 使用UPLC／Xevo-TQ联用仪器对HILIC LC-MS方法开发标准品和细胞萃取物进行定量分析 在UPLC优化过程中进行的标准品分析表明使用酸性pH的流动相缓冲液可提高对氨基酸和有机酸的分辨率、信噪比和峰对称性。图3比较了对一种包含约2μg/mL L-赖氨酸的纯氨基酸溶液所