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PCR技术介绍Introduction to PCR Technology;一. DNA结构和体内复制 二. PCR 1. PCR发展简史 2. PCR基本概念 3. PCR原理 三. 荧光定量PCR 1. 荧光定量PCR原理 2. 荧光定量PCR工作流程 3. 荧光定量PCR结果分析 4. 荧光定量PCR应用 四.基因芯片技术平台 ——HPV23亚型检测技术;——DNA结构;;;——细胞内DNA复制;;1.DNA螺旋的松弛与解练;3.DNA聚合酶 延长子链 ;聚合酶链反应的发明;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;;;1983年春，Mullis发展出PCR的概念； 1983年9月，Mullis用大肠杆菌DNA聚合酶做了第一个PCR实验，只用一个循环； 1983年12月，用同位素标记法看到了10个循环后的49 bp长度的第一个PCR片断； 1985年12月20日，Mullis的同事Saiki在Science上发了一篇论文，方法中用了PCR技术，导致Mullis的文章到处被拒； 1985年10月25日申请了PCR的专利，1987年7月28日批准（专利号4,683,202 ），这回Mullis是第一发明人。 1986年5月，Mullis在冷泉港实验室做专题报告，全世界从此开始学习PCR的方法； 1986年6月，Cetus公司纯化了第一种高温菌DNA聚合酶，Taq DNA polymerase，这是85年春天Mullis建议做的； 1988年，第一台PCR仪问世； 1991年，Hoffman LaRoche以3亿美元的代价从Cetus公司获得全权开发权。 ;PCR不只是一个方法改进; 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。;PCR 基本原理;; ;DNA模板;;PE-2400;PCR反应基本过程;平台期效应; PCR扩增产物的分析法;所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 ;TaqMan探针技术;定量 PCR，TaqMan体系;log[DNA];标本的采集;标本的采集;标本采集时间对扩增检测结果的影响;标本采集部位的准备;标本采集的类型和采集量;采样质量的评价;采样及运输容器;标本采集中的防污染;标本的稳定化处理;标本的运输;标本的保存;实验室分区管理平面图;试剂准备区（Ⅰ 区）;标本处理区（Ⅱ 区）;基因扩增检测区（Ⅲ 区）;结果分析;;结果判断(HBV); 1. 传染性疾病：了解病原体对人体的感染情况，判断病 情或对某一种药物的疗效进行评估 2. 肿瘤研究：通过对癌基因或抑癌基因mRNA的表达数 量进行检测，来判断肿瘤的发病情况，还可以通过查 找基因的表达差异，推断发病机理 3. 其他（遗传病、环境监测、SNP分析等）;HBV DNA;乙型肝炎病毒;病毒形态和结构;1.大球形颗粒;Dane颗粒;;2.小球形颗粒;3.管形颗粒;基因结构;基因结构;HBV DNA正链为开放读码区，不能编码病毒蛋白。 HBV DNA负链有四个开放区，分别称为S、C、P及X，能编码全部已知的HBV蛋白质。;S区可分为二部分，S基因和前S基因。 S基因（核苷酸155～833）能编码主要表面蛋白。 S基因之前是一个能编码163个氨基酸（2，848-154）的前S基因，编码Pre S1和Pre S2蛋白。 ;C区基因 前C基因 C基因 编码HBeAg 编码HBcAg;P区最长，约占基因组75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。;X区（核苷酸1，374～1，835）可能编码有154个氨基酸的碱性多肽，长链的裂口位于此区。;HBV DNA定量检测的意义;对于持续性感染的病毒性肝炎，病毒血症水平的消长与肝脏损害情况和预后相关。 随着病毒感染后肝脏病理损害的进展，病毒核酸逐渐在宿主血液中积蓄，直到发展为肝病晚期时，病毒血症也达到了最高水平，故如果病毒核酸水平升高表示病恶化，预后不良；水平降低说明向好的方向发展。 血中HBV核酸定量