pcr说明及注意事项.ppt

PCR技术产生的背景： DNA双螺旋结构于1953年发现，自此确立了它就是细 胞里携带遗传信息的分子。 第一个细胞内用来复制DNA所需的聚合酶polymerase，即PCR之P），也早在1956年分离成功。 几十年来，在试管内复制DNA已是许多实验室的例行工作。 ; ;PCR技术的基本原理;常用的PCR技术;通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途： (1) 生成双链DNA中的特异序列作为探针；(2) 由少量mRNA生成 cDNA文库；(3) 从cDNA中克隆某些基因；(4) 生成大量DNA以进行序列测定；(5) 突变的分析；;我们可以利用PCR做些什么工作;要将两段100多个碱基的片段连起来用PCR可以吗？？没有酶切位点！各位高手可否介绍一下经验？？连接PCR要注意些什么？？多谢！！！ (丁香园某求助帖）  ; 可以。我就这样做过。1. 针对这两个片段设计两对引物。第一对引物的下??引物和第二对引物的上游引物各长40bp左右，并有20bp左右的同源性配对序列（象骨折打的石板）。2. 分别PCR这两段序列，并分别回收纯化这两个PCR片段。3. 将上述两个PCR片段加入一PCR体系中，只不加引物，其他同普通的PCR，做PCR。4. 回收200多bp的PCR目的片段。放入测序载体，测序证实。 (丁香园某回答贴） ;; 在设计引物之前应当明确PCR试验的目的以及各种资料和信息 1. 引物长度一般为18-35bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性 2，上下游引物长度相差一般不超过3个碱基 ;3. 引物GC含量尽量是40％－60％ 4. 尽量避免发卡结构，特别是3‘端发卡结构  5. 尽量避免引物二聚体特别是3‘端引物二聚 体 ;6，尽量避免错配，特别是3‘端错配 7，尽量避免3‘端最后一个碱基是A。 8，上下游Tm值相差最好不要超过5°C ;9， Tm值的计算： Tm＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）(本公式适用于20个碱基以下，20个碱基以上推荐使用软件计算） 10,根据需要可在引物5‘端加入酶切位 点和保护碱基 ;11,引物设计的最后一项：Genebank网比对/Blast ;使用软件帮助设计引物;关于PCR引物设计的思考 1，任何引物设计软件都不能代替人性化的思考。2,核酸结构是三维的，而一般的引物设计软件很难考虑到核酸的三维结构。3，理论与实践并不一定完全一致 关于PCR试验结果的思考 ;;2，引物 引物的特异性很重要 3，引物浓度 0.1~1pmol/ul 引物浓度太低PCR产量低，引物浓度太高容易引发非特异性扩增。 ;Mg离子的作用主要是 dNTP-Mg 与核酸骨架相互作用 并能影响Polymerase的活性，一般的情况下 Mg的浓度在0.5-5mM之间调整，同样要记住的是在调整了dNTPs的浓度后要相应的调整Mg离子的浓度。在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜  ;Mg离子浓度升高则PCR特异性增加， Mg离子降低则有可能出现非特异性扩增 退火温度 升高退火温度PCR产量低，降低退火温度则有可能出现非特异性扩增 ;保护碱基的个数：(NEB) BamHⅠ 1 EcoR Ⅰ 1 Hind Ⅲ 2 Xho Ⅰ 1 PstⅠ 3 Xba Ⅰ 1 保护碱基的性质：灵活处理 ; 本实验室经常使用宝生物的Taq酶 rTaq： 普通Taq酶，1kb以下片断使用比较合适 ;EX－Taq 具有一定的保真性，2kb以下片断使用比较合适 LA－Taq 保真性比EX－Taq要好，适用于2kb以上的片断 ;1，具有3‘－5’核酸外切酶活性，所以具有保真性 2，PCR产物末端没有T 3, 扩增效率往往不如普通Taq酶，可以用普通Taq酶和pfu按20：1混合使用 ;PCR究竟能扩多长的片段？;RT-PCR;各有优缺点。比较如下： 二步法: 可使用oligo(dT)，随机六聚体引物或基因特异性引物进行第一链合成。高灵活性：可选用不同的酶系统。可优化困难的RT-PCR反应。可实现长模板mRNA的转录扩赠(使用ELONG ASE Enzyme Mix) 。 最适用于克隆产物(使用高确限度酶或混合酶) 。 ;一步法: 第一链合成时只能使用基因特异性引物。 高灵敏度：使用预混合的SUPETSCRIPT H和