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食物中维生素B12的测定方法食物中维生素B12的测定方法
食物中维生素B6 的测定方法
微生物法
1.原理
维生素B6在酸性介质中对热比较稳定,但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是微生物法它的优点是:1.特异性高、精密度好、操作简单(不需要特殊设备,易于推广,样品不需要进行一系列的提纯步骤)、准确度高。它的缺点是:耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。
2.适用范围
GB/T 17407-1998,适用于药物、食物及饲料的检测
3.仪器
电热恒温培养箱
电热手提式压力蒸汽消毒器
液体快速混合器
离心机
722光栅分光光度计
硬质玻璃试管
4.试剂
(1) 0.22mol/L硫酸:于2000ml烧杯中加入700ml水,加入12.32ml H2SO4,用水稀释至1000ml。
(2) 0.5mol/L硫酸:于2000ml烧杯中加入700ml水,加入28ml H2SO4,用水稀释至1000ml。
(3) 10mol/L氢氧化钠:溶200g NaOH于水中,稀释至500ml。
(4) 0.1mol/L氢氧化钠:取10ml 10mol/L NaOH,用水稀释至1000ml。
(5) 溴甲酚绿:0.04%溶液,称取0.1g溴甲酚绿于研钵中,加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨,加少许水继续研磨,直至完全溶解,用水稀释到250ml。
(6) 培养基:称取吡哆醇Y培养基5.3g,溶解于100ml蒸馏水中。
(7) 100ug/ml吡哆醇标准储备液:称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中,保存于4℃冰箱中,稳定1个月。
(8) 1ug/ml吡哆醇标准中间液:,取1ml吡哆醇标准储备液,稀释至100ml。
(9) 琼脂培养基:吡哆醇Y培养基5.3g,琼脂1.2g,稀释至100ml。
(10) 1.5MOL/l生理盐水:取9gNaCl溶于1000ml水中。
5.菌种的制备与保存
5.1储备菌种的制备与保存:以卡尔斯伯酵母菌 ATCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中,在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时,取出后置于冰箱中保存,至多不超过两星期。保存两周以上的菌种,不能立即用作制备接种用的种子液,一定要在使用前每天移种一次,连续2~3天,方可使用,否则生长不好。
5.2种子培养液的制备:加0.5ml 50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中,加入5ml基本培养基,塞好棉塞,于压力蒸汽消毒器内(高压锅)151b压力下消毒10min,取出,置于冰箱中,此管可保留数星期之久。
6.操作步骤
整个步骤要避光
(1) 样品制备:取样0.5~10g(VB6含量不超过10ng)放入100ml三角瓶中,加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时,取出,于水中冷却,用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5,用溴甲酚绿做指示剂。(指示剂由黄-黄绿色),将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中,用蒸馏水定容至100ml,滤纸过滤,保存滤液即样液于冰箱内备测定(保存期不超过36小时)。
(2) 接种液的制备:使用前一天,将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中,可同时接种两管,在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟(3000rpm)倾去上部液体,用已消毒的生理盐水淋洗2次,再加10ml消毒过的生理盐水,将离心管置于液体快速混合器上混合,使菌种成为混悬体,将此液倒入已消毒的注射器内,立即使用。3.样品标准曲线的测定:取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液,从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液,浓度为50ng/ml,3组试管各加0,0.02,0.04,0.08,0.12,和0.16ml工作液,再加5ml吡哆醇Y培养基,混匀,加棉塞。
(3) 试样的测定:在试管中分别加入0.05,0.10,0.20ml样液,再加入5ml吡哆醇Y培养基,用棉塞塞住试管,将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅(121℃,15磅/英寸2)高压10min,冷至室温备用。
(4) 接种和培养:每管接种一滴接种液,于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时
(5) 测定:从恒温箱中取出后,用722分光光度计测量,用空白管调零。550nm波长下,测定各管的吸光度值,以标准管所含VB6的浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制VB6标准工作曲线,用测定管得到的吸光度值,在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。
7.计算
各样管的吡哆醇含量A为:
A(ng/ml)=(x1/V1+x2/V2+x3/V3)/3
则样品的吡哆醇含量为:
mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104
每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1,x2,x3;
取液量分别为V1,V2,V3
样品重W(g)取液量
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