食物中维生素B12的测定方法.doc

食物中维生素B6 的测定方法 微生物法 1.原理 维生素B6在酸性介质中对热比较稳定，但在碱性介质中对热不稳定。测量维生素B6比较经典的方法是微生物法它的优点是：1.特异性高、精密度好、操作简单（不需要特殊设备，易于推广，样品不需要进行一系列的提纯步骤）、准确度高。它的缺点是：耗时长、必须经常保存菌种、试剂较贵。 2.适用范围 GB/T 17407-1998，适用于药物、食物及饲料的检测 3.仪器 电热恒温培养箱 电热手提式压力蒸汽消毒器 液体快速混合器 离心机 722光栅分光光度计 硬质玻璃试管 4.试剂 （1） 0.22mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入12.32ml H2SO4，用水稀释至1000ml。 （2） 0.5mol/L硫酸：于2000ml烧杯中加入700ml水，加入28ml H2SO4，用水稀释至1000ml。 （3） 10mol/L氢氧化钠：溶200g NaOH于水中，稀释至500ml。 （4） 0.1mol/L氢氧化钠：取10ml 10mol/L NaOH，用水稀释至1000ml。 （5） 溴甲酚绿：0.04%溶液，称取0.1g溴甲酚绿于研钵中，加1.4ml0.1mol/LNaOH研磨，加少许水继续研磨，直至完全溶解，用水稀释到250ml。 （6） 培养基：称取吡哆醇Y培养基5.3g，溶解于100ml蒸馏水中。 （7） 100ug/ml吡哆醇标准储备液：称取122mg盐酸吡哆醇标准溶于1L25%乙醇中，保存于4℃冰箱中，稳定1个月。 （8） 1ug/ml吡哆醇标准中间液：，取1ml吡哆醇标准储备液，稀释至100ml。 （9） 琼脂培养基：吡哆醇Y培养基5.3g，琼脂1.2g，稀释至100ml。 （10） 1.5MOL/l生理盐水：取9gNaCl溶于1000ml水中。 5.菌种的制备与保存 5.1储备菌种的制备与保存：以卡尔斯伯酵母菌 ATCC No.9080简称SC?纯菌种接入2个或多个琼脂培养基管中，在30±0.5℃恒温箱中培养18-20小时，取出后置于冰箱中保存，至多不超过两星期。保存两周以上的菌种，不能立即用作制备接种用的种子液，一定要在使用前每天移种一次，连续2~3天，方可使用，否则生长不好。 5.2种子培养液的制备：加0.5ml 50ng/ml的VB6标准应用液于尖管中，加入5ml基本培养基，塞好棉塞，于压力蒸汽消毒器内（高压锅）151b压力下消毒10min，取出，置于冰箱中，此管可保留数星期之久。 6.操作步骤 整个步骤要避光 （1） 样品制备：取样0.5~10g（VB6含量不超过10ng）放入100ml三角瓶中，加0.22mol/LH2SO472ml。放入高压蒸汽锅121℃下水解5个小时，取出，于水中冷却，用10mol/LNaOH和0.5mol/LH2SO4调PH值至4.5，用溴甲酚绿做指示剂。（指示剂由黄-黄绿色），将三角瓶内的溶液转移到100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至100ml，滤纸过滤，保存滤液即样液于冰箱内备测定（保存期不超过36小时）。 （2） 接种液的制备：使用前一天，将卡尔斯伯酵母菌菌种由储备菌种管移种于已消毒的种子培养液中，可同时接种两管，在30±0.5℃的恒温箱中培养18-20小时。取出离心10分钟（3000rpm）倾去上部液体，用已消毒的生理盐水淋洗2次，再加10ml消毒过的生理盐水，将离心管置于液体快速混合器上混合，使菌种成为混悬体，将此液倒入已消毒的注射器内，立即使用。3.样品标准曲线的测定：取标准储备液2ml稀释至200ml成为中间液，从中间液中取5ml稀释至100ml作为工作液，浓度为50ng/ml，3组试管各加0，0.02，0.04，0.08，0.12，和0.16ml工作液，再加5ml吡哆醇Y培养基，混匀，加棉塞。 （3） 试样的测定：在试管中分别加入0.05，0.10，0.20ml样液，再加入5ml吡哆醇Y培养基，用棉塞塞住试管，将制备好的标准曲线和试样测定管放入高压锅（121℃，15磅/英寸2）高压10min，冷至室温备用。 （4） 接种和培养：每管接种一滴接种液，于30±0.5℃恒温箱中培养18-22小时 （5） 测定：从恒温箱中取出后，用722分光光度计测量，用空白管调零。550nm波长下，测定各管的吸光度值，以标准管所含VB6的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制VB6标准工作曲线，用测定管得到的吸光度值，在标准曲线上查到测定管内所含VB6的量。 7.计算 各样管的吡哆醇含量A为： A（ng/ml）=（x1/V1+x2/V2+x3/V3）/3 则样品的吡哆醇含量为： mg/100g=A×V×102/w×106=A×V/W×104 每个样品各测定管的吡哆醇含量为x1，x2，x3； 取液量分别为V1，V2，V3 样品重W（g）取液量