10食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程讲义.doc

xxxxx公司 食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程编号起草人日期审核人日期批准人日期实施日期第 版文件密级1目的 规范食品中大肠菌群计数测定的标准操作规程。 2范围 本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 3术语和定义 3.1 大肠菌群coliforms 在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 3.2 最可能数most probable number，MPN 基于泊松分布的一种间接计数方法。 4责任 质量部组织制订、化验室负责实施。 5内容 5.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 5.1.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 5.1.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 5.1.3 恒温水浴箱：46 ℃±1 ℃。 5.1.4 天平：感量0.1 g。 5.1.5 均质器。 5.1.6 振荡器。 5.1.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。 5.1.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 5.1.9 无菌培养皿：直径90 mm。 5.1.10 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。 5.1.11 菌落计数器。 5.2培养基和试剂 5.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A 中A.1。 5.2.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A 中A.2。 5.2.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A 中A.3。 5.2.4 磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.4。 5.2.5 无菌生理盐水：见附录A 中A.5。 5.2.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A 中A.6。 5.2.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A 中A.7。 5.3大肠菌群MPN 计数法 5.3.1 检验程序 大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。 图1 大肠菌群MPN 计数法检验程序 5.3.2 操作步骤 5.3.2.1 样品的稀释 5.3.2.1.1 固体和半固体样品：称取25 g 样品,放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内,8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10 的样品匀液。 5.3.2.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10 的样品匀液。 5.3.2.1.3 样品匀液的pH 值应在6.5～7.5 之间，必要时分别用1 mol/L NaOH 或1 mol/L HCl 调节。 5.3.2.1.4 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。 5.3.2.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1 次，换用1 支1 mL 无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 5.3.2.2 初发酵试验 每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续 培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 5.3.2.3 复发酵试验 用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 5.3.2.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 按5.3.2.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。 5.4大肠菌群平板计数法 5.4.1检验程序 大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。 图2 大肠菌群平板计数法检验程序 5.4.2 操作步骤 5.4.2.1 样品的稀