分子生物学实验课 RNA提取.pptVIP

RNA提取;实验内容;注意事项 ; 1、mRNA: 1-5% 5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。 1）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。 3`poly(A)尾巴结构 20-200个A，翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基40S: 18S=1874nt;1) 实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。 2) 将研磨后的组织(小米粒大小)转移至1mL Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上。 使组织细胞充分裂解，可见液体变成均匀浑浊状。 3) 室温孵育10 min。（使核酸蛋白复合物完全分离）;1、异硫氰酸胍法 GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 RNase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。 特点：需低温操作。 2、Trizol 试剂（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 简单、快速、提取量大、纯度高。 3、mRNA提取试剂盒 真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素可结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。;1、DEPC ( 二乙基焦炭酸盐)：最常用的RNase抑制剂 与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白变性； 工作浓度：0.05%---0.1%(DEPC水)，室温磁力搅拌20分钟。 用于浸泡各种器材。 　 灭活条件：高压。 试剂配制：无RNase的溶液(用DEPC水配制, 高压) 储存方法： 4 ?C 或液氮。不能用聚苯乙烯器皿。 2、肝素： 工作浓度：0.1—10mg/ml 可与DEPC联合应用， 具有极强的效果。 3、RNasin 其可直接抑制RNA酶活性;4) 加入200 ?l氯仿， 震荡混匀20-30s， 室温放置5 min 此期间液体开始分层， 不要轻易搅动液体 5) 10000rpm 离心 5min。;7) 加500 uL异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min。 10, 000?rpm，4?C，离心10 min．弃上清。 8) 加1ml 75%乙醇洗涤管壁。;9) 7500rpm，4?C 离心 1 min，弃上清。 再离心几秒钟，用加样器将管壁液体完全移净。 10) 室温干燥3－5 min ;室温干燥 —— 避免在37 ?C 孵箱中过度干燥而无法溶解。 RNA沉淀必须绝对干燥 —— 微量乙醇残留，容易造成逆 转录反应的失败。 RNA沉淀干燥环节是逆转录成功的关键。;11）溶解RNA：吸取9 ?l冰冷DEPC水，吹打溶解RNA。 （溶解的RNA放置在冰上保存）;12)溶解后的 RNA ,放到冰上备用，将用于RT-PCR反应。 ;Thank You for your attention!