分子生物学实验课 第二次课PCR T-A 连接实验 课件.pdfVIP

各位老师： （1）实验课开始前，请查看PCR反应体系的加样 试剂。 注意：PCR专用 的 水应与PCR其它试剂放 到一起，均放到每排实验台的中间。 （2）上课后，请首先进行PCR反应体系的加样， 然后再进行讲解！ （3）请确认实验系列老师将学生的平板铺好，下 次课使用！ 实验二、 目的基因片断的体 外扩增及T-A 连接 实验课安排 1. RNA提取与逆转录 2. PCR T T 目的基因 T载体 2. T-A 连接 重组 质粒 3.连接产物转化 重组质粒 平板筛选 的鉴定 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 上次实验回顾 实验一 RNA的提取、逆转录反应 1、提取真核细胞的总RNA -----避免RNA酶污染 2、逆转录反应 -----获得cDNA 实验二、目的基因片断的体外扩增及T-A 连接 实验操作内容 有声课件 — PCR反应体系的建立 （1）： PCR的基本原理 — PCR 反应的进行 及反应体系的组成 — PCR产物的电泳 PCR反应动画 — 结果观察与分析 （2）：PCR 反应条件的 — PCR产物回收 确定及PCR常见问题的解 — T-A 连接 决方案 实验操作一、建立 PCR 反应体系 1. 取 1 支200 ?l 微量离心管（在第一组同学的实验台上方的平皿里）中， 用 Marker 笔 在管的侧面 标记； 2. 依次加入下列试剂： 1）模板DNA (上次课逆转录的cDNA） 4 ?l 2）下列试剂的加入顺序可以改变 10X PCR buffer (含MgCl2 ) 5 ?l dNTPs (10mM) 1 ?l 3 ’引物 (10?mol/L) 1 ?l 5 ’引物 (10?mol/L) 1 ?l 3）加去离子水 ，补足50?l 体系 4）Taq DNA 聚合酶(2U/?l) 1 ?l 3. 轻弹管底混匀，然后放入离心机的套管内，用离心机甩一下； 4. 将PCR小管交给老师，老师统一将样品放入PCR仪。 注意： （1） PCR相关试剂均放在每排实验台上方中 间位置处的蓝色 圆盒中 （2）加样的体积要准确，1 ?l 的体积不应该 超过白色枪头的第一个格。 实验操作二、 PCR 反应的进行 1、将样品放入 PCR 仪中 2. PCR反应条件 94 ℃ 30 S DNA变性 (Denaturation) 55 ℃ 30 S 退火 (Annealing) 72 ℃ 45 S 延伸 (Extension)