分子生物学实验课 第三次课 感受态制备 转化.pdfVIP

分子生物学实验课 实验一 、总RNA的提取及逆转录 实验二 、PCR及琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物的TA连接 实验三、感受态细胞制备及转化 实验三 感受态细胞制备及重组DNA转化 1. RNA提取与逆转录 2. PCR T T 目的基因 T载体 2. T-A 连接 重组 质粒 3.连接产物转化 平板筛选 重组质粒 的鉴定 无质粒的E.Coli 死亡 有质粒的E.Coli 存活 实验三 感受态细胞制备及重组DNA转化 实验操作内容 有声课件 — 感受态细胞的制备 录像（1）： 转化 — 连接产物的转化 录像（2）：蓝白筛选 实验操作一、??受态细胞的制备 （一） 原理： 大肠杆菌在低渗 CaCl2 溶液的条件下， 细菌变得膨胀而易于外源基因的导入。 （二）注意事项： （1）制备感受态细胞时，应注意在冰上操作。 （2）无菌操作。 超净台的火焰附近是无菌区。 枪头、微量离心管、试剂等均已高压消毒， 并已经放臵于超净台中。 （3） 在超净台中，请使用自己组的加样器。 实验操作一、感受态细胞的制备 （三）操作步骤： 1. 将大肠杆菌在LB琼脂培养基上划线，臵37oC孵箱 培养12-16小时； 2. 从琼脂平板上挑取单菌落，接种于2ml LB培养基 中，37oC,225rpm水浴摇床中震荡培养12-16h； 3. 取 1ml 上 述培 养物接种于 100ml LB培 养基中 ， 37oC, 225rpm水浴摇床中震荡培养，直至OD值为 0.5左右(约3小时)。 （上述步骤1，2，3，已经由实验室完成） 水浴摇床 实验操作一、感受态细胞的制备 4. 取1ml 菌液，冰浴 5 min； 5. 6000rpm离心 3 min。 用加样器吸弃上清，除净剩余液体。 （注意无菌操作） 轻轻弹匀菌体沉淀，加入500μl 冰冷的100mmol/L CaCl2 致敏液悬浮细胞，冰浴5分钟； 6. 重复步骤5，感受态细胞制备完毕。 感受态细胞在4oC可保存1周； 若长期保存：加甘油至终浓度15%， 分装后臵-70oC。 实验操作 二、连接产物的转化 （一） 原理： 1、10 ?l 连接产物可以进行 1~4 次转化。 2、转化时一般要加入少量的DMSO， 其作用：防止细胞被胀破、提高转化效率。 3、热休克作用原理： Ca2+ 诱导大肠杆菌成为感受态细胞， 感受态细胞经热休克（42oC，45～60 s） 发生收缩作用，使细胞膜出现空隙， 细胞外的DNA进入细胞。 实验操作 二、连接产物的转化 （二） 操作 1. 在冰上，向感受态细胞中加入 3 ?l DMSO，轻弹管底混匀。 再加入10 ?l 连接反应液，温和混匀。 臵冰上10分钟； 2. 42oC，45秒。然后迅速放回冰中 5 分钟； 3. 将转化后细菌加入到1ml LB培养液中； 4. 37oC, 225rpm 摇床中震荡培养 30min； 播放录像: 1、 2 。 5. 6,000rpm离心 20s，弃掉800 ?l上清, 用剩余液体重悬菌体； 6. 将上述菌液涂匀于含有Amp的LB琼脂培养板； 7. 教师: 待菌液被平板吸收后， 将平皿倒臵于37oC孵箱中培养12-16h。 实验报告