分子生物学实验课 逆转录反应.pptVIP

逆转录反应;一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合成DNA的反应。;一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合成DNA的反应。 二、逆转录酶： DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶) ;一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合成DNA的反应。 二、逆转录酶： DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 最适工作温度为42℃。 具有较强的DNA聚合酶活性和RNA酶H活性。 RNA酶H活性： 水解DNA和RNA杂合链中的RNA链。 ;一、概念： 在逆转录酶的作用下，以RNA作为模板，合成DNA的反应。 二、逆转录酶： DNA聚合酶（以RNA为模板） 1、AMV (禽成髓细胞瘤病毒逆转录酶) 2、MMLV (Money 鼠白血病病毒逆转录酶) 最适工作温度为37℃。 具有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。 ;三、引物： 1、Oligo(dT)15-18：5—TTTTTTTTTTTTTTTTTT—3‘ 2、特异性引物： 3、随机引物： ;四、实验操作： 1.RNA链的线性化。 2.逆转录反应。 3.终止反应。;四、实验操作： 1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性地结合到 PolyA 尾。 总RNA 9 ?l Oligo dT (0.05?g/ml) 1 ?l (终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合， 置65℃水浴10min，立即冰浴2min（防止RNA形成二级结构）。;四、实验操作： 1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性地结合到 PolyA 尾。 2.逆转录反应。 5?RT-buffer 4 ?l RNasin (40U/ml) 1 ?l dNTPs (10mmol/L) 4 ?l AMV 1 ?l 轻弹管底混合，离心10秒，置42oC 水浴1h。;四、实验操作： 1.打开RNA链之间的二级结构，使Oligo(dT)特异性地结合到 PolyA 尾。 2.逆转录反应。 3.终止反应。 将上述反应移至68oC水浴10min，以灭活RTase，然后冰浴，保存备用。;五、注意事项： 1. 防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂； 2. 防止非特异性扩增，必须设阴性对照； 3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。 ???用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、 β-Actin（β-肌动蛋白）等。 其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差； 4. 防止DNA的污染，采用DNA酶处理RNA样品。;Thank You for your attention!