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分子生物学实验课 实验仪器的使用及注意事项.pptVIP

分子生物学实验课 实验仪器的使用及注意事项.ppt

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分子生物学实验课 ;实验仪器的使用及注意事项;?一、加样器 1、 用途 2、 如何使用?;练习:加样器读数为 100,实际体积各为多少?; 1)选择加样器 观察读数;调节读数; 2)安装吸头(紧密); 3)吸取液体 按加样器第一挡;将吸头插入液面下适当深度;松开拇指(缓慢),吸取液体 4)打出液体 抬起加样器;估计体积是否正确;移入容器;按到加样器第二档;打出液体(匀速);加样器使用注意事项:; 1、打开电源 2、离心管中的液体为2/3,盖紧盖子,防止离心机被腐蚀。;实验课的整体安排(两条线);PCR引物设计及相关软件数据库的使用;介绍如何查找基因的序列;介绍常规的生物学软件的使用;(一)如何查找基因的序列;GenBank 数据库;1. 打开/ ;三种途径可以从Genbank数据库中查到基因的序列;1. 根据文献; ,在Search后的下拉框中选择Nucleotide,把Genbank ID号输入GO前面的文本框中,点“GO”,就可以找到他了;;打开/ ;Limits的意思其实就是高级检索,你可以在这里对检索词进行很多限制,这样能大大精简查询结果。;这样就能获得我们所想要寻找的基因信息。 提醒:注意一下右侧的基因 相关信息,很有用的。;;;若你只想获得序列(例如设计PCR引物,可以选择FASTA格式。 FASTA格式的序列文件,没有其他数字和格式的干扰。;在获得FASTA格式的序列后,需要关注一下Genebank 中CDS的信息,来确认该基因的编码序列。;IFN-? cDNA的编码序列;3. 从Nucletide数据库中直接查找序列;;与gene 数据库进入,查找的序列是一样的。;2.从Gene 数据库种查找基因序列的优势:;(二)如何设计PCR引物;什么是引物? 引物设计的原则是什么? 介绍常用的引物设计的软件。 引物同源性分析;引物是人工合成的两段寡核苷酸序列。;引物设计的原则;;(4)引物方向:5?→3?;引物5 ?端修饰包括:加酶切位点; 引入点突变、插入突变、缺失突变序列; 加入其它短序列包括起始密码子,终止密码子。 标记生物素、荧光、地高辛等; ; 引物的5’-端设计限制性酶切位点后PCR示意图;(7)引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin);(9)比较引物与基因组的同源性;已知IFN-? cDNA序列, 你该如何设计引物?;1. 设计PCR引物 ---扩增目的基因的全长 ;扩增目的基因的全长; 5’ ATGAAATATACAAGTTATATCT …………………….TCGAAGAGCATCCCAGTAA 3’ 3’ TACTTTATATGTTCAATATAGA………………………..AGCTTCTCGTAGGGTCATT 5’ ;第二步:GC比值;Tm值 ;第三步:检测引物的发夹结构,二聚体等。 ;经过上述三个步骤后,即将获得扩增IFN-gamma全长的引物:;扩增目的基因的部分序列;Homo sapiens high mobility group box 1 (HMGB1), mRNA NCBI Reference Sequence: NM_002128.4 gi|118918424|ref|NM_002128.4| Homo sapiens high mobility group box 1 (HMGB1), mRNA TGGAGAGTAATGTTACAGAGCGGAGAGAGTGAGGAGGCTGCGTCTGGCTCCCGCTCTCACAGCCATTGCAGTACATTGAGCTCCATAGAGACAGCGCCGGGGCAAGTGAGAGCCGGACGGGCACTGGGCGACTCTGTGCCTCGCTGAGGAAAAATAACTAAACATGGGCAAAGGAGATCCTAAGAAGCCGAGAGGCAAAATGTCATCATATGCATTTTTTGTGCAAACTTGTCGGGAGGAGCATAAGAAGAAGCACCCAGATGCTTCAGTCAACTTCTCAGAGTTTTCTAAGAAGTGCTCAGAGAGGTGGAAGACCATGTCTGCTAAAGAGAAAGGAAAATTTGAAGATATGGCAAAAGCGGACAAGGCCCGTTATGAAAGAGAAATGAAAACCTATATCCCTCCCAAAGGGGAGACAAAAAAGAAGTTCAAGGATCCCAATGCACCCAAGAGGCCTCCTTCGGCCTTCTTCCTCTTCTGCTCTGAGTATCGCCCAAAAATCAAAGGAGAACATCCTGGCCTGTCCATTGGTGATGTTGCG

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