上海交通大学微生物实验课件实验十病毒血凝和血凝抑制试验选编.ppt

实验十病毒血凝和血凝抑制; 一、 实验目的 1: 学会通过鸡胚接种增殖的病毒的收集 2: 掌握病毒血凝和血凝抑制试验的基本原理和基本操作 3: 理解病毒血凝和血凝抑制试验的应用;二 、实验原理 1:红细胞凝集 某些病毒（如流感病毒，新成疫病毒，麻疹病毒等）拥有血凝素糖蛋白，可与人或某些动物的红细胞表面的相应受体结合，从而呈现红细胞凝集现象。在此，病毒与红细胞是配体与受体的关系，而不是颗粒性抗原与相应抗体作用的凝集反应。 这种凝聚多种病毒都具有，不是完全特异的;;;3:利用已知抗体，可通过红细胞凝集抑制试验鉴定某些具红细胞凝集特性的病毒，同样也可利用已知病毒抗原，通过红细胞凝集抑制试验来测定抗体水平，从而评价疫苗的免疫效果，或动物是否受到病毒感染 血凝实验是病毒与红细胞的凝集 血凝抑制试验是抗原抗体的特异性血清实验;4 红细胞的解脱现象 某些具红细胞凝集特性的病毒还拥有神经氨酸酶活性，其可使病毒从红细胞上解脱下来，因此，血凝试验的时间太长，可能会在高浓度孔见到类似阴性的反应结果，实验过程中必须控制好时间。 ; 三 、实验操作 (一)病毒的鸡胚接种与培养 (二)病毒尿囊液的收集 37℃培养72小时的鸡胚--放置于4 ℃，致死鸡胚--消毒气室--用镊子打开气室-打开壳膜--用移液器或吸管收集尿囊液于1.5毫升离心管--5000转，离心5分钟，以去除细胞沉淀--上清液作血凝 和 血凝抑制试验作用. 观察鸡胚的病变特征 (三)制备1%浓度的鸡红细胞 采集新鲜的抗凝血,以生理盐水洗3次,每次离心5分钟,转速为4000转,最后用生理盐水配制成1%浓度。 ;(四)红细胞凝集试验（每2人一块血凝板） 1、50μl的生理盐水加入96孔微量板A 、 B行的1-12孔。 2、被检病毒液50μl分别加入A 、 B行（一行为标准病毒，一行为自己收集的病毒）的第一孔，然后倍比稀释至第11孔，弃去50μl，第12孔不加任何病毒液，为阴性对照。 3、加50μl的1%鸡红细胞于12个孔，按病毒的低浓度至高浓度加入。 4、混匀、室温静止30min 。 5、确定红细胞100%凝聚的??毒的最高稀释度，为HA滴度。 ;6、血凝效价（HA）的确定 将板直立，首先观察红细胞阴性对照，应呈逗点状。红细胞凝集孔呈颗粒状附于孔底。能凝集红细胞的最高稀释度即为血凝效价。;结果判定;(五) 4单位病毒液的配制 以出现红细胞凝集现象的病毒最高稀释度为1个血凝单位,将原病毒液稀释成4倍于最高稀释度的病毒液,即为4单位病毒液。例如:出现红细胞凝集现象的最高稀释度是26次方(病毒的血凝效价为26),那么, 4单位病毒液就为病毒原液作24稀释。 ;(六)病毒的红细胞凝集抑制试验 1、加生理盐水50μl于96孔板的E、F两排的1-12孔。 2、各加标准血清50μl于E、F两排第一孔，倍比稀释到第10孔，弃50μl。 3、E排加50μl4个血凝单位病毒抗原，加至11孔 F排加另一种病毒，同上 4、然后各孔加50μl的1%鸡红细胞，混匀，室温静置30min 。 5、观察结果，确定血清的HI效价。血凝被抑制的抗体最高稀释度即为血清抗体的血凝抑制效价（HI效价）。 ;HA和HI结果判定;比较一下，你自己培养的病毒与提供的病毒的血凝效价和血凝抑制效价，分析一下实验中关键点是哪些？;实验报告