常用分子生物学技术概述-2009.ppt

The Department of Biochemistry and Molecular Biology 生物化学与分子生物学教研室 ;常用分子生物学技术 基因组与蛋白质组 基因工程 基因诊断 基因治疗 生物信息学 考试;常用分子生物学技术的原理及应用 The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application;操作对象：;主要内容;主要技术;提取DNA总的原则;核酸分子抽提的技术路线的设计;3、核酸的浓缩、沉淀与洗涤 沉淀可去除部分杂质与某些盐离子 加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等） 少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤;鉴定与保存;浓度与纯度鉴定;NanoDrop ND-1000 spectrophotometer. ;2. 荧光光度法;3 EB荧光分析法 荧光染料溴化乙锭(EB)，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。 适用于半定量分析。;完整性鉴定;凝胶电泳法：;BIO－RAD Gel Doc 2000凝胶成像系统 ;ImageQuant RT ECL 凝胶成像系统 ;核酸的贮存——DNA保存 ;核酸的贮存——RNA保存;质粒DNA的提取Plasmid DNA Preparation ;质粒DNA的提取;质粒结构图;质粒的分离与提取则是最常用、最基本的实验技术． 1、细菌的培养 主要步骤： 2、细菌的收集与裂解 3、分离纯化; 质粒DNA的小量制备 2-5ml 质粒DNA的大量制备 500ml 碱裂解法 方法 煮沸法 SDS裂解法 Triton-溶菌酶法 ;质粒DNA提取方法的选择 ;质粒提取的主要方法;质粒提取的主要方法;质粒提取的主要方法;质粒DNA的纯化;;基因组DNA/RNA的提取 Genomic DNA/RNA Preparation ;DNA提取;总的技术路线;酚抽提法;DNA EXTRACTION VIRTUAL LAB ;DNA　的　提　取;;RNA　的　提　取;RNA提取的主要方法;;RNA质量检测：; Industry standard of RNA quality control;mRNA的分离;oligo(dT)-纤维素层析柱法;磁珠分离法 ;核酸的分离纯化方法;核酸的分离纯化方法;; ;;聚 合 酶 链 反 应Polymerase Chain Reaction;1985年，Mullis创建了聚合酶链反应技术，简称PCR技术。(1993年 诺贝尔奖） 这是一种在体外由引物介导的DNA序列酶促合成反应，可以增加靶基因的拷贝数达百万倍，极大的提高了检测灵敏度。;PCR技术简介;一、PCR技术的起源;PCR技术对靶基因扩增的工作原理;;二、PCR体系基本组成成分;热稳定DNA聚合酶;嗜热水生菌(Thermus aquaticus) ;反应体系里的其它几种成分;三、PCR技术引物设计;PCR技术引物设计的原则;引导DNA合成的寡核苷酸引物; 例： His-Phe-Pro-Phe-Met-Lys 5’-CAY TTY CCN TTY ATG AAR Y= Pyrimidine N= any base R= purine ;常用的引物设计软件;四、PCR的基本反应步骤;（一）目的基因的克隆 （二）基因的体外突变 （三）DNA和RNA的微量分析 （四）DNA序列测定 （五）基因突变分析;;六、几种重要的PCR衍生技术;反转录PCR（Reverse transcription PCR RT-PCT);RT-PCR;原位PCR：是指直接用细胞涂片或石蜡片包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。;用限制性内切酶消化DNA片段，然后用连接酶将酶切产物连接成环状，再用已知序列上两端相反方向的引物进行PCR。 ;锚定PCR(anchored PCR);;巢式PCR（nested PCR,N-PCR） ;不对称PCR（asymmetric PCR） ;荧光实时定量PCR(Fluorescence Quantified real time –PCR);??? 实时荧光定量PCR原理;1）SYBR荧光染料(非特异性嵌入荧光染料);;2）TaqMan荧光探针：;TaqMan 荧光探针工作原理;非特异性嵌入荧光染料;核 酸 序 列 分