现代生物技术制药工艺学讲解.ppt

第二讲 工程生物构建技术 第一节 目标基因的分离克隆技术 第二节 基因克隆载体 第三节 DNA技术的体外重组技术 第四节 重组DNA分子的转化与筛选技术 第五节 分子杂交技术 第六节 突变与检测技术;基因工程生物： 通过分子克隆和转基因等基因工程技术创造的生物，包括重组微生物、转基因植物和动物。在欧洲一般称为遗传修饰生物（genetically modified organism, GMO）。 构建一个基因工程生物的基本过程：目标基因的克隆、表达载体的构建、宿主生物的遗传转化，转化个体的筛选鉴定和纯化至遗传稳定性。 ;生物细胞的基本结构与遗传信息的表达 生物细胞的基本结构 微生物：单细胞原核生物：大肠杆菌等细菌 多细胞原核生物：链霉菌等放线菌 单细胞真核生物：酵母等 多细胞真核生物：霉菌、食用菌等 植物：红豆杉、紫草、人参、烟草等 动物：鱼、虾、昆虫、鼠、人等;;生物体;表 皮 细 胞 肌 肉 细 胞 神 经 细 胞;细胞结构;生物遗传信息的传递;生物遗传信息的载体：DNA、RNA结构;半保留复制方式, 半不连续复制过程 起始：识别起始位点；局部解旋，引发酶以DNA链为模板好合成RNA引物。 链延伸：先导链：沿模板链3－5方向，以5－3方向合成新DNA链，不断延伸。后续链：沿模板链3－5方向，合成新冈崎片段，除去RNA引物，聚合酶活性合成DNA（即切口平移），缺口由连接酶连接。 终止：完成整个DNA链的复制后，终止。原核生物DNA为环状，存在一个复制起始点和终止点。真核生物的DNA的复制是多起始点同时进行，终止点在端粒。 ;起始：RNA聚合酶识别DNA上的启动子位点。 延伸：ATP，GTP，CTP，UTP为前体。方向5－3。碱基配对原子为T＝A，A＝U，G＝C。 终止：终止信号，使合成的RNA具有发夹结构和一系列U残基。无终止信号的，由蛋白质因子去终止。;蛋白质翻译 起始：起始密码子AUG，由起始tRNAfMet识别。 延伸：包括进位、转肽、移位。 终止：终止密码子UAG、UAA、UGA）出现，切断肽键与tRNA之间的键。多肽链、tRNA、mRNA离开核糖体。;第一节???? 目标基因的分离克隆 扩增：已知功能基因；基因文库筛选：未知基因 一、PCR技术 PCR (Polymerase chain reaction, PCR)：聚合酶链式反应，是由DNA聚合酶催化下，对特定的DNA 序列进行的复制反应。每循环一次，产物增加一倍，呈几何级数增加。由Mullis于1987年发明，现已成为试验室的常规操作，并已实现了自动化。是生物技术革命性的象征。本质是根据生物体的DNA复制原理在体外合成基因。;PCR单反应原理与过程;理论上讲，每循环结束，目的片段的数量约增加一倍，即呈几何级数增加。可用公式表示：Yn＝Y0（1＋X）n，其中Yn为n循环后的拷贝数，Y0为起始拷贝数， X为扩增效率，n为循环数。 ;PCR扩增的反应体系组成 目标序列（模板 DNA）：100－10 000bp,pg 寡核苷酸引物：两条，分别与目标序列的5和3’端完全互补，可设计酶切位点，并有2－4个保护碱基。长度为21－27 bp,Tm为50－65℃。 脱氧核苷酸： 4种dNTP,即dATP,dCTP,dGTP,dTTP DNA聚合酶: Taq聚合酶，耐高温 缓冲溶液：50 mM KCl、10 mM Tris－HCl,1.5 mM MgCl2 ;聚合酶;酶 ;PCR操作指南 引物设计：长度20～30 bp， 保护碱基，酶切位点，与模板配对长度18～25 bp。 内部和引物之间不能有3bp以上重复和反向重复序列；GC含量40～60％，4种碱基分布均匀。 Tm值之差不能大于5℃，扩增产物的Tm值与引物的Tm值之差不能低于10℃。 15～20 bp引物：Tm ＝2（A＋T）＋4（C＋G）。 14～40 bp：Tm＝81.5℃＋16.6(lg[K+])＋0.41([G+C]%) 一般在50℃～65℃之间，温度越高特异性越强。有引物设计软件可提供帮助，进行计算。;反应缓冲液：主要考虑Mg离子浓度的影响,1.5~5.0 mM。 退火温度：根据产物基因的Tm值和长度计算。 退火时间：一般30秒至2分钟，根据长度计算。 延伸时间：一般1－3分钟。 循环次数：25－40次，根据模板含量。 PCR反应应该包括正、负对照，无模板、无引物、无聚合酶等对照，以便检测PCR的进行和结果分析。整个过程在PCR仪内，编程后自动完成。;如果非特异扩增比较严重，为了防止非特异性引物与模板的退火配对，可采用热启动操作。在先把引物和模板混合并加热到高于非特异性结合温度， 如果引物与模板配对后的熔链