刘小龙-循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义选编.ppt

循环肿瘤DNA(ctDNA)检测策略及临床意义;肿瘤诊疗的困境：早期诊断困难，错过最佳治疗时机；易复发转移，预后差；放化疗易产生耐受；缺乏有效的治疗靶点等。 早诊早治，实时监控、靶向用药及个体化诊疗是提高肿瘤远期生存率、降低死亡率的关键。;肿瘤诊断方法;循环肿瘤DNA(ctDNA);ctDNA发展简史;Nature Reviews Cancer?11,?426-437?(June 2011)?|?doi:10.1038/nrc3066 Cell-free nucleic acids as biomarkers in cancer patients ;研究热点;ctDNA优势;ctDNA检测技术;敏感度;数字PCR;利用数字PCR监测肺癌病人中第一次服用埃罗替尼抗肿瘤药物后的血浆EGFR突变情况。 经过治疗后，所有病人的EGFR突变都出现下降，其中有8个病人突变完全消失。 有6个病人的EGFR突变在后续出现上升，提前揭示疾病进展。另外3个病人的EGFR突变没有变化，病情无明显进展。 ;结合数字PCR与流式技术，利用特异性PCR引物扩增目标突变区后，与??珠（磁珠上固定有特异的PCR 引物）混合进行油包水单分子扩增反应。反乳化作用后，利用不同颜色的荧光探针结合磁珠上的PCR产物，发出红色或绿色荧光。使用流式细胞仪分析磁珠颜色来确定突变情况。 ;利用肿瘤组织进行sanger测序定义肿瘤组织的基因突变； 再利用Beaming技术检测18例癌症病人中192份血浆样本中ctDNA的突变情况，检测灵敏度可达到0.005%。 ;;Comparison of ctDNA, CEA and imaging dynamics in individual study subjects;标记扩增深度测序（TAM-Seq）;设计了48对引物去扩增TP53，EGFR，BARF，KRAS等癌症相关基因的5995bp突变区域 同时可对10个特异的癌症突变位点进行监控 用于确定多发癌症患者的复发病灶 用于监控癌症患者的肿瘤动态发展;癌症个体化深度测序 (CAPP-Seq);Stage I 检出率50% Stage II-IV 检出率100% 特异性可达到96% 突变检出率0.02% ;;ctDNA的分析指标;ctDNA的分析指标;乳腺癌病人（尤其在转移性乳腺癌）的血浆cfDNA的完整性显著下调，而血浆cfDNA的浓度显著上调，可作为早期诊断的标志物，具有较好的敏感度和特异性。;肝癌病人的血浆中存在两种不同长度的DNA分子：短链DNA分子（150bp）和长链DNA分子（ 180bp ）； 短链DNA分子与ctDNA突变率及拷贝数异常相关，且与ctDNA浓度正相关； 长链DNA分子不携带肿瘤相关ctDNA特征，且与ctDNA浓度负相关。;;;ctDNA的分析指标; 利用数字PCR检测640例不同癌症病人的血浆ctDNA，在超过75%的病人血液中检测到ctDNA，原发癌检出率约为50%。 在结肠癌，胃癌，胰腺癌，乳腺癌中，ctDNA检出率分别为73%, 57%, 48%, 50% 。; 相对于原发癌，ctDNA在转移癌中检出率更高，且分期越高，ctDNA检出率也更高； 可用于耐药突变的检测； ctDNA是普遍适用的、敏感和特异的标志物,可用于不同类型癌症患者的临床监测。;N Engl J Med 2013; 368:1199-1209;Comparison of Circulating Tumor DNA, CA 15-3, and Circulating Tumor Cells as Blood-Based Biomarkers; Comparison of Circulating Biomarkers to Monitor Tumor Dynamics and Predict Survival.;;; 利用区域捕获测序技术检测乳腺癌原发瘤及肝脏转移瘤的基因突变情况，并监控血液中ctDNA在治疗过程中的动态变化。; ctDNA在监测肿瘤的动态发展中具有更高的灵敏度和特异性； ctDNA能比蛋白类标志物CA15.3更早的预测肿瘤动态发展情况。;相对于传统的影像学及蛋白类血清标志物，通过评估ctDNA的突变频率能更早、更准确的预测结肠癌患者肿瘤经治疗后的动态发展情况。;ctDNA的分析指标;利用亚硫酸氢盐平行测序检测不同肿瘤患者（肝癌，乳腺癌，肺癌，鼻咽癌等）血浆DNA甲基化发生情况及血浆DNA拷贝数异常情况，用于肿瘤的诊断及肿瘤负荷的监测；;Percentage of bins showing hypomethylation in HCC patients and chronic hepatitis B virus (HBV) carriers with c