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ISSR(inter-sequencerepeat)分子标记的实验原理及操作流程
ISSR(inter-simple sequence repeat)分子标记的实验原理及操作流程
ISSR(inter-simple?sequence?repeat)标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在?3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在?SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。
关键词: HYPERLINK /tag.php?tag=%B1%EA%BC%C7 标记 HYPERLINK /tag.php?tag=%B7%D6%D7%D3 分子 HYPERLINK /tag.php?tag=ISSR ISSR HYPERLINK /tag.php?tag=inter-simple inter-simple HYPERLINK /tag.php?tag=sequence sequence HYPERLINK /tag.php?tag=repeat repeat HYPERLINK /tag.php?tag=SSR%D2%FD%CE%EF SSR???物 HYPERLINK /tag.php?tag=RAPD RAPD HYPERLINK /tag.php?tag=%B7%D6%D7%D3%B1%EA%BC%C7 分子标记 HYPERLINK /tag.php?tag=%B5%A5%B9%D1%BE%DB%BA%CB%CB%E1 单寡聚核酸
ISSR标记 ISSR(inter-simple?sequence?repeat)标记是一种类似RAPD,但利用包含重复序列并在 3’或5’锚定的单寡聚核酸引物对基因组进行扩增的标记系统,即用SSR引物来扩增重复序列之间的区域。其原理具体是,ISSR标记根据生物广泛存在 SSR的特点,利用在生物基因组常出现的SSR本身设计引物,无需预先克隆和测序。用于扩增的引物一般为16-18个碱基序列,由1-4个碱基组成的串联重复和几个非重复的锚定碱基组成,从而保证了引物与基因组DNA 中SSR的5’或3’末端结合,导致位于反向排列、间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。 ? 一、实验材料 不同来源的 DNA(30-50ng/ul)。? 二、实验设备? HYPERLINK /yp/product-list-127.html \t _blank PCR仪, HYPERLINK /yp/product-list-1063.html \t _blank PCR管或硅化的 0.5ml?eppendorf管,电泳装置, HYPERLINK /yp/product-list-234.html \t _blank 凝胶成像仪。? 三、试剂? 1、 ISSR引物:购买成品或根据加拿大British?Columbia大学设计的ISSR引物序列(见附录)自己合成。? 2、Taq酶 3、10xPCR?缓冲液 ??????? 4、MgCl2:25mmol/L。? 5、 dNTP:2.5mmol/L。??
四、操作步骤:? 1. 在25ul反应体系中,加入? 模板DNA 1ul (30-50ng)? ISSR引物 1ul (约5pmol)? 10xPCR Buffer 2.5ul? MgCl2 2ul? dNTP 2ul? Taq酶 1单位(U)? 加ddH2O 至 25ul? 混匀稍离心, 加一滴(约20 ul)矿物油。? 2. 在 HYPERLINK /yp/product-list-127.html \t _blank PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟, 45℃-68℃ 40秒, 72℃ 1-2分钟,共40轮循环。? 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟,4℃保存。 4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于1.6% 或1.8% HYPERLINK /yp/product-list-642.html \t _blank 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V(电压低带型整齐, 分辨率高)。? 5. 电泳结束,溴化乙锭染色20分钟。 6. 用 HYPERLINK /yp/product-list-234.html \t _blank 凝胶成像仪观察、拍照。? 操作流程简图:
注:样品可以采用新鲜样品,硅胶干燥样品,标本等???? DNA提取可采用CTAB或 HYPE
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