一种达托霉素的提取纯化方法.doc

2. 如权利要求1 所述的提取纯化方法，其特征是所述的：1）、富集:A、在含有达托霉素的发酵液中投入大孔吸附树脂，吸附后收集树脂，装入解吸柱中；B、用含低分子醇浓度低于50% 且含有1-5% 盐的水溶液pH6-7 进行解吸；C、用含低分子醇浓度高于50% 的水溶液洗脱解吸柱，收集解吸液；D、解吸液纳滤浓缩；2）、粗提取：A、酸性柱层析：调浓缩液pH 至中等酸性；上柱后用40-55% 的低分子醇浓度水溶液阶梯梯度洗脱；纳滤浓缩；B、中性柱层析：调浓缩液pH 至中性，向浓缩液中加入1-5% 盐；上柱后用含30-45% 低分子醇且含1-5% 盐的水溶液洗脱，洗脱量为树脂柱体积的3~4 倍；用20-30% 低分子醇水溶液洗脱，收集洗脱流分；调pH 至中性；纳滤机浓缩；3）、精制：A、中性柱层析：浓缩液中加入1~5% 盐，调整浓缩液pH 中性；上柱后用5% 低分子醇水溶液洗脱层析柱，洗脱量为柱体积的6-9 倍；用10-20% 低分子醇水溶液洗脱，洗脱量为柱体积的8-13 倍，收集洗脱流分；收集的流分调pH 至中性；用HPLC 法检测所收集的流分，合并达托霉素归一化含量大于等于92% 的流分，纳滤机浓缩；B、酸性柱层析：调浓缩pH 至中等酸性；上柱后，采用低分子醇和挥发性酸水溶液组成的混合洗脱剂进行线性梯度洗脱，洗脱量3~6 倍柱体积时开始收集，在洗脱量达到8~14 倍柱体积时停止洗脱；合并达托霉素归一化含量大于等于95% 的流分；4）、冻干：冷冻干燥至粉末后，在20℃ ~30℃，压力低于10Pa 的条件下干燥2~5 小时，得成品。3. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤1）中的大孔吸附树脂为HZ818、X-5、HZ804、HZ816 中的任一种；步骤2）的中的层析柱填料为PRP 512、C18、或C8 中的任一种，步骤3）层析柱的填料选用C18 或C8。4. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征步骤1）中是所述的解吸剂为甲醇、乙醇、丙醇或丁醇中的任一种。5. 如权利要求4 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的解吸剂为乙醇。6. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的盐为氯化钠???乙酸铵中的任一种。7. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的步骤2）A 中的洗脱为先以40% 的低浓度乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积的2~4 倍；再换成45±2% 的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍，最后用55% 的乙醇水溶液洗脱，用量为柱体积3~5 倍。8. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸性层析中上柱液调pH 的酸为盐酸、硫酸、磷酸、丙酸、草酸、甲酸或乙酸中的任一种或几种。9. 如权利要求8 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的酸为磷酸或甲酸。10. 如权利要求2 所述的达托霉素的提取纯化方法，其特征是所述的中性柱层析中上柱液调pH 的碱为氢氧化钠、氢氧化钾中任一种。一种达托霉素的提取纯化方法技术领域[0001] 本发明属药物化学领域，具体涉及一种达托霉素的提取纯化方法。[0002]背景技术[0003] 达托霉素是一类称为环酯肽类新抗生素家族的第一个产品。它是从小链霉菌（Streptomyces parvus ）发酵液当中提取得到的十三个氨基酸组成的结构新颖的环脂肽类抗生素，其中十个氨基酸构成环状结构，在环外癸酸和色氨酸发生酯化。它不仅具有新颖的化学结构，且其作用模式也与任一已获准抗生素不同。它能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，由此迅速杀死革兰阳性菌。达托霉素除能作用于大多数临床相关革兰阳性菌外，更重要的是在体外对已呈甲氧西林（methicillin）、万古霉素和利奈唑胺等耐药性分离菌株仍具强力活性。[0004] 达托霉素为发酵产物，通过发酵培养得到的发酵滤液，发酵过程中会产生大量的色素及与达托霉素结构相近似的副产物如脱水达托霉素，因此达托霉素的提取纯化方法较复杂。一般达托霉素产生菌，生产能力不稳定，产量较低，发酵副产物较多，杂质较多，导致后提取工作较为复杂，大大地增加了后序的提纯难度，难以获得高纯度的最终产物，从而无法产业化生产。[0005] 对达托霉素后序的提取纯化方法已经有不少文献报导，比如安徽丰原发酵技术工程研究有限公司申请的《一种高纯达托霉素的制备方法》（申请号200910085837.X），它公开的大致工艺为：发酵液经超滤、纳滤、阳离子树脂吸附酸洗、阴离子树脂中和，纳滤浓缩、结晶。膜过滤收率达到98 － 99％，产品经结晶后纯度也能得到98.5％以上。但达托霉素是个两性物质，等电点约是pH4-5，在不