南方医科大学分生实验-绿色荧光蛋白EGFP的基因克隆.docx

绿色荧光蛋白（EGFP）的基因克隆 南方医科大学 学院 摘 要 本实验旨在学习基因克隆并检验，绿色荧光蛋白基因转化入宿主细胞后很稳定，对多数宿主的生理无影响，是常用的报道基因，便于实验。本实验通过将含有目的基因GFP的pEGFP-N1质粒和pMD18-T载体进行酶切、电泳、回收、连接、转入、筛选之后，把GFP基因成功导入到大肠杆菌DH5α (克隆菌)中，从而实现荧光蛋白基因的克隆和表达。 关键词：绿色荧光蛋白 克隆 表达 实验名称绿色荧光蛋白的基因克隆实验日期2015- ~ 2015-实验地点合作者指导老师评分教师签名批改日期实验目的 学习使用限制性内切酶进行DNA酶切的原理和方法。 学习掌握琼脂糖凝胶电泳的基本原理和操作方法。 掌握PCR技术原理和PCR仪的操作方法。 学习PCR产物的TA克隆的基本原理和操作步骤。 了解和掌握大肠杆菌的制备方法的基本原理和操作要点以及DNA转化大肠杆菌的原理和方法。 掌握双酶切法鉴定重组DNA的基本原理和操作步骤，以及菌落PCR鉴定重组DNA的基本原理和方法。 掌握IPTG诱导GFP基因表达的基本原理和操作步骤 实验原理 pEGFP-N1质粒 T载体 材料与方法： 实验材料： 质粒：pEGFP-N1 T载体：pUCm-T 菌种：DH5?(克隆菌) PCR引物： F——GGCATATGGTGAGCAAGGGCGA R——CGGGATCCCTTGTACAGCTCGTC Tm=56 实验试剂： 即用型蓝白T载体（pMD18-T vector cloning kit） 快速DNA连接试剂盒 限制性内切酶：EcoR I（Fermentas） Axygen质粒提取试剂盒 抗生素：氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan) X-gal、IPTG等 实验仪器： 超净工作台，恒温摇床，高压灭菌锅，恒温培养箱，台式高速离心机，大容量冷冻离心机，PCR仪，紫外分光光度计，水平电泳槽，垂直电泳槽，电泳仪，凝胶成像系统，制冰机、超低温冰箱等 方法 分离目的基因→限制酶切割目的基因与载体→连接重组体→转入受体细胞→筛选重组体、转化子 实验具体流程 获取外源基因 碱裂解法提取质粒 使用Axygen质粒提取试剂盒 彻底弃上清 弃上清 菌液 离心1300r pm,1min 瞬时离心 加350μl 溶液S3 加250μl 溶液S2 加250μl 溶液S1 漩涡震荡 ???倒数次 悬浮沉淀 取上清600μl加到吸附柱中 离心13000rpm,10min 颠倒数次 离心 放置3-5min 13000rpm,1min 弃滤液，加入600μl洗涤液W 弃滤液，加入600μl洗涤液W 离心 离心 放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加40μl洗脱液 13000rpm,1min 13000rpm,1min PCR扩增 / -20℃保存备用 弃滤液 空柱离心 离心 13000rpm,2min 13000rpm,1min PCR扩增目的基因GFP 取0.2 ml PCR反应管一支，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)： H2O6?l质粒DNA（pEGFP-N1）2?l引物GFP1 (10?M)1?l引物GFP2 (10?M)1?lPremix Taq10?l总体积20?l加完试剂后，将PCR反应管放到PCR仪上。 PCE参数设置： 94℃预变性5分钟后开始以下循环 94℃ 30 秒 56℃ 30 秒 30 循环 72℃ 1 分钟 72℃ 7 分钟 4 ℃ 保温 琼脂糖凝胶电泳检测所提取的质粒 凝胶准备→胶床准备→铺胶→静置→胶床置于电泳槽中→加电泳缓冲液→拔梳子→上样（1mlPCR产物，6?l loading buffer混合点样）→点marker→电泳→取出凝胶→拍照 构建重组DNA 使用即用型蓝白T载体和快速DNA连接试剂盒。按下表加入试剂：为了检验转化是否成功，设置对照组实验 实验组①对照组②即用型蓝白T载体1 ?l1 ?lPCR扩增产物1 ?l—Control Insert DNA—1 ?l快速连接缓冲液(2X)5 ?l5 ?l超纯水-ddH2O2.5 ?l2.5 ?lRapid T4 DNA ligase0.5 ?l0.5 ?l总体积10 ?l10 ?l添加完成后，冰箱内16℃反应45分钟 重组DNA的转化 预先制备好感受态细胞。 转化