蛋白质纯化及常用设备简介.pptxVIP

汇报人：李保健 牛莹莹;1;蛋白质纯化原则;蛋白质纯化的前处理;机械破碎法;反复冻融法： 将待破碎的细胞置-20℃冰箱内完全冻结，然后在室温融化，如此反复2-3次，大部分组织细胞及细胞内颗粒可被融破，此法主要适用于对组织细胞的处理。如果要提取细菌或病毒中的蛋白或核酸，可用类似的冷热交替法，先将细胞置于沸水浴中，90℃左右维持数分钟，然后立即置于冰浴中使之迅速冷却，绝大部分细胞被破碎。;超声破碎法： 利用超声波的机械振动使流体形成局部减压发生内部流动、漩涡生成和消失，产生足以使细胞破碎的压力。超声波所使用的频率为1-20kHz不等。一次超声处理1-2分钟，总时间为10-15分钟。 优点:超声破碎法操作简单、省时且作用较温和，一般组织细胞皆易破碎，而细菌，尤其是真菌的厚膜孢子则较难打破。超声破碎时需间歇进行，以避免长时间产热使抗原破坏 ;自溶法： 利用组织细胞和微生物的自身酶系，在一定的pH值和温度下，使细胞裂解。动物组织细胞自溶的温度常选用0-4℃，对微生物常选用室温。自溶时需加入少量防腐剂，如甲苯、氯仿等叠氮钠能抑制美的活力，不宜使用。 ;酶处理法： 溶菌酶在碱性条件下，能溶解革兰阳性菌的细胞壁，有EDTA存在时，溶菌酶也能溶解某些革兰氏阴性菌的细胞壁；纤维素酶主要溶解真菌细胞壁；蜗牛酶能溶解酵母菌细胞壁和植物细胞壁。优点：酶处理法具有作用条件温和，内含物成分不易受破坏，细胞壁损坏程度可以控制等特点 ;表面活性剂处理法： 在适当的温度、pH值和低离子强度的条件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡，使细胞膜通透性改变而导致细胞溶解。常用的表面活性剂有SDS、去氧胆酸钠、二乙基十六烷基溴、吐温、Triton-100等。本法作用较温和，多用于细菌的破碎 ;高速组织捣碎机及匀浆机;蛋白质粗制品的获得 选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。 比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。;蛋白质粗制品的获得常用方法 ; 离心： 是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。分为差速离心法和密度梯度离心法 ;1. 差速沉降离心法：? 这是最普通的离心法。即采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降速度不同的颗粒，在不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。此法一般用于分离沉降系数相差较大的颗粒。?; 差速离心首先要选择好颗粒沉降所需的离心力和离心时间。当以一定的离心力在一定的离心时间内进行离心时，在离心管底部就会得到最大和最重颗粒的沉淀，分出的上清液在加大转速下再进行离心，又得到第二部分较大较重颗粒的沉淀及含较小和较轻颗粒的上清液，如此多次离心处理，即能把液体中的不同颗粒较好地分离开。此法所得的沉淀是不均一的，仍杂有其它成分，需经过2～3次的再悬浮和再离心，才能得到较纯的颗粒。?; 此法主要由于组织匀浆液中分离细胞器和病毒，其优点是：操作简易，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。缺点是：须多次离心，沉淀中有夹带，分离效果差，不能一次得到纯颗粒，沉淀于管底的颗粒受挤压，容易变性失活;2. 密度梯度区带离心法（简称区带离心法）：?区带离心法是将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 此法的优点是：①分离效果好，可一次获得较纯颗粒；②适应范围广，能象差速离心法一样分离具有沉降系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度差的颗粒；③颗粒不会挤压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。? 此法的缺点是：①离心时间较长；②需要制备惰性梯度介质溶液；③操作严格，不易掌握。?;离心管先装好密度梯度介质溶液，样品液加在梯度介质的液面上，离心时，由于离心力的作用，颗粒离开原样品层，按不同沉降速度向管底沉降，离心一定时间后，沉降的颗粒逐渐分开，最后形成一系列界面清楚的不连续区带，沉降系数越大，往下沉降越快，所呈现的区带也越低，离心必须在沉降最快的大颗粒到达管底前结束，样品颗粒的密度要大于梯度介质的密度。梯度介质通常用蔗糖溶液，其最大密度和浓度可达1.28 kg/cm3和60％。 此离心法的关键是选择合适的离心转速和时间 。;透析法： 是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质，达到分离的方法。例如分离和纯化皂甙、蛋白质、多肽、多糖等物质时，可用透析法以除去无机盐、单糖、双糖等杂质。反之也可将大分子的杂质留在半透膜内，而将小分子的物质通过半透膜进入膜外溶液中，而加以分离精制;透析是否成