第11章电泳分离技术.pptVIP

第十一章 电泳分离技术;概述;;;;电泳分析的特点; 电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以实现下列目标： 1、提高分辨率及灵敏度。 2、简化操作，缩短电泳时间。 3、扩大应用范围。;电泳的分类;2.电泳按支持介质的不同，分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳等。 3.电泳按支持介质形状的不同，分为薄层电泳、板电泳、柱电泳等。 4.按用途不同可分为分析电泳、制备电泳、定量免疫电泳、连续制备电泳等。 5.按所用电压不同可分为： ①低压电泳：100v~500v，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。 ②高压电泳：1000v~5000v，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离;影响电泳速度的因素;V: 泳动速度cm/秒or分 d: 泳动距离cm t: 电泳时间 (秒/分) E: 电场强度 伏特/cm;凝胶电泳;聚丙烯酰胺;原理;聚丙烯酰胺凝胶电泳的特点 ;凝胶特性;; 有效孔径决定蛋白质的分离;;聚合方式;特别注意;琼脂糖凝胶电泳;;主要性能指标;;凝胶电泳的应用——常规聚丙烯酰胺电泳;缓冲系统的选择;理想显色剂的7S 安全（safety） 灵敏（sensitivity） 简单（simplicity） 特异性（specificity） 快速（speed） 稳定（stability） 兼容性（synergy）;考马斯亮蓝R250：灵敏度是氨基黑10B的5倍，但不适用与酸溶蛋白、醇溶蛋白。 考马斯亮蓝G250：灵敏度不如R250，但不溶于酸性溶液。 考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍. ;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;银染法;双胺银染过程： 1. 胶在50%甲醇中浸泡至少1小时. 2. 配制溶液A 0.8克硝酸银到4毫升无离子水。B21毫升0.36% 氢氧化钠和1.4毫升14.8摩尔的氢氧化胺. 3. 将A滴到B中，用无离子水加至100毫升，此溶液临用前配制，染色15分钟. 4. 无离子水漂洗5分钟. 5. 显色液：2.5毫升1%柠檬酸与0.25毫升37%甲醛混合，加无离子水至500毫升。显色约10分钟，蛋白带出现。 6. 无离子水漂洗后用50%甲醇终止显色。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.; 十二烷基硫酸钠（SDS）的聚丙酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定。 ; SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理是SDS能和蛋白质结合并使蛋白质带有大量的负电荷，大大超过其原来所带电荷，从而使各天然蛋白质分子间的电荷差别消除；同时通过断裂分子内和分子间的氢键，蛋白质的结构也在SDS作用下变得松散，形状趋于一致。排除了电泳过程中电荷的影响，使SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳时，蛋白质迁移率的差异仅是相对分子质量的函数。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.;在一定范围内，电泳迁移率与相对分子质量的对数呈线性关系。 测定蛋白质相对分子质量时，用已知相对分子质量的蛋白质与被测样品在同一条件下进行电泳，最后计算出被测样品的分子量。 由于蛋白质与SDS的结合对电泳影响显著，因此需要注意SDS单体浓度、离子强度等影响因素。 用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。;Evaluation only. Created with Aspose.Slides for .NET 3.5 Client Profile 5.2.0.0. Copyright 2004-2011 Aspose Pty Ltd.; 蛋白质 Z 在左边的 native中无法向下泳动，但在右边的 SDS则可以依其分子量正确泳动；因此一般使用上，SDS的应用较广泛。 在 SDS下，虽然 X 分子被解析成单元体，因此分子量由 1