研究哈茨木霉T23与几种病原菌对峙培养时相关基因的表达.doc

研究哈茨木霉T23与几种病原菌对峙培养时相关基因的表达 通过哈茨木霉T23与大丽轮枝孢菌、腐皮镰刀菌等病原菌的对峙培养，采用差异表达基因的方法，寻找哈茨木霉T23与病原菌作用的关键基因，克隆抑病基因的序列，并进行功能验证 1材料 实验材料 哈茨木霉T23，大丽轮枝孢菌，腐皮镰刀菌等病原菌 1.2试剂及试剂的配置 2仪器设备 3操作步骤 3.1哈茨木霉的培养 木霉的培养 3.11 PD液体培养基的制备 去皮马铃薯200g，切成小块，加水煮沸30min，将滤液补足1000ml ，加葡萄糖20g，121摄氏度高温灭菌30min。 3.12 发酵液的制备 斜面中保存的菌种，接种前一周转移到平皿中，将5株活化的木霉的菌块接入到500ml装有100mlPD液体培养基的摇瓶，接入量为5个菌块。在28℃以下250rpm（转每分）的转速培养7d。 3.13 孢子悬浮液的制备 在木霉的培养管中加入5ml的无菌水，刮取孢子，倒出孢子悬浮液，用适量的无菌水稀释，用血球计数板记数，计算每毫升孢子悬浮液中的孢子数。 附：用血球记数板法测量孢子数，调配出5个不同浓度梯度，配用。 3.2哈茨木霉T23的筛选 3.3哈茨木霉T23与大丽轮枝孢菌，腐皮镰刀菌的对峙培养 不同温度下培养 木霉菌和病病菌分别 置不同温度下黑暗培养 72h 后， 用打孔器 （ 5mm） 沿 其菌落边缘打菌碟， 分别接种于 pda 平板中央， 25°c 黑暗培养7d， 逐日观察菌丝生长。 平皿对峙培养 各供试木霉菌和几种病原菌病菌，分别置于25°C黑暗条件下培养72h用打孔器 （ 5mm） 沿其菌落边缘打菌碟， 接种于 pda 平板上， 两者相距5mm 同时设只接木霉菌和病病菌的平板为对照， 每处理重复 3 次。分别于 10C 15C 25C 30C 35C黑暗条件下恒温培养， 逐日观察并记录木霉菌和病病菌的菌落相向半径。用十字交叉法测量供试菌株菌丝生长半径， 用下述公式计算抑制率 菌落半径 3.4RNA的提取 提取两组平行材料中的总RNA，此实验中需提取哈茨木霉RNA，采用上海生物工程公司代售的Trizol试剂（BBI, 加拿大）提取总RNA 3.41取两组哈茨木霉T23菌液各5mL置于10mL预冷离心管中 3.42在离心管中加入2 mL Trizol试剂，剧烈震荡离心管3-5次（注：禁用漩涡振荡器） 3.43室温静置10分钟 3.44 4℃ 12000 rpm 离心15 min，弃沉淀 3.45吸取上层水相，至另一新离心管中（注：千万不要吸取中间相） 3.46稀释水相一倍 3.47加入1/2 体积异丙醇，再加入1 /2体积的高盐溶液（1.2 mol/L NaCl），上下颠倒混匀，室温静置15 min 3.48 4℃ 12000 rpm离心15 min，弃上清 3.49收集DNA沉淀，用冰冷的75%乙醇轻轻漂洗，4℃ 8000 rpm离 心3 min，弃上清，重复两次 3.49.1于室温晾干10 min（注：不要过分干燥，否则RNA很难溶解） 3.49.2溶于300 μLDEPC处理的灭菌双蒸水15 min 3.49.3加入1/2 体积异丙醇，上下颠倒混匀，-70℃静置15 min 3.49.4重复3.49-3.49.1步骤 3.49.5 50 μL DEPC处理的灭菌双蒸水重新溶解RNA 3.5反转录 在逆转录酶的作用下，以Oligo dT18MN为锚定引物将RNA反转录成cDNA 3.51取两组哈茨木霉T23RNA液2ug至于离心管中，具体参照M-MLV Reverse Transcriptase (Promega, 美国)的说明书进行 3.52底物与引物混合变性，体系如下 总RNA2ug ,Oligo(dT)18 （0.5 μg/uL）1uL, DEPC处理的水3uL , Total volume 6uL 3.53短暂离心后，70°C水浴5min 3.54冰浴3 min 3.55向关内按照顺序加入以下试剂 试剂体积5×M-MLV buffer2 μLdNTP Mix (10 mmol/L)0.5 μLRibonuclear Inhibitor（50 U）0.5 μLDEPC处理的H2O1 μLTotal volume9 μL 3.56水浴37℃ 5 min。 3.57加入加1 μL（200 U）Reverse Trascriptase（M-MLV）。 3.58 42℃水浴60 min。 3.59 70℃水浴10 min。 3.59.1 冰浴5 min，然后-20℃储存