第2章免疫组织化学的基本理论与技术.pptVIP

第二章 免疫组织化学的基本理论与技术;一、免疫组织化学的基本理论 1 原理：免疫组织化学(Immunohistochemistry) 是利用抗原与抗体特异性结合的原理，使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。 可在光镜和电镜水平观察细胞膜及细胞内某种抗原物质的存在，从而为研究生命大分子，特别是酶、蛋白质、激素及受体蛋白等在组织内分布、细胞内定位以及代谢状态等，提供了特异性强、灵敏度高而又直观化的原位分析细胞组成物质的手段。;2 免疫组织化学全过程包括: ⑴ 抗原提取 ⑵ 抗体制备 (博士德,华美,基因公司等购买) ⑶ 抗体标记 ⑷ 免疫染色 ⑸ 观察分析等过程 ;二、抗原与抗体; 2.抗体 Ab 定义：是机体受到抗原刺激后，由免疫细胞合成并分泌出 一类具有与抗原发生特异性结合的球蛋白。 存在部位：主要存在于血清内。 分类：根据重链的结构及抗原特异性不同分为五种， 即IgG、 IgD、IgE、IgA、IgM。 根据制备方法不同分为两种 即单克隆抗体与多克隆抗体;IgG的结构 ;浆细胞;单克隆抗体;;三、免疫组织化学的基本技术; 1.组织标本制备 （1）标本新鲜：一般在2h以内进行。 （2）取材部位：取含待检抗原部位，还应取病灶与正常交界处，即抗原阳性和阴性区，必要时取远离病变区的正常组织作为对照。对于只研究正常组织抗原，取材时应尽可能避开坏死区。 （3）避免挤压：剪刀、刀片的刃口要锋利。 （4）取材大小：做石蜡切片的组织厚度不宜超过2mm，用作冰冻切片的以4mm为宜。 （5）固定:化学固定,或于液氮中,或－70℃冰箱中保存。;2．细胞标本制备; (2) 穿刺吸取涂片法 应用：实质器官的病变区。 方法：①穿刺液较少时直接涂片,力求均匀。 ②穿刺液较多时，穿刺液滴入2毫升 Hanks液内，离心，制成细胞悬 液，吸一滴于载玻片上，轻涂， 干燥后固定。 优点：细胞均匀。 缺点：细胞易变形。; (3)体液沉淀涂片法 1) 细胞数较多，取一滴直接涂片。 2) 细胞数较少时，取5毫升自然沉淀液以1500rpm离心10min，弃上清，将沉淀涂片，略干后固定备用。; （4）体外培养细胞 1)贴壁生长的细胞：将盖玻片插入培养液中，让细胞自然贴壁于盖玻片上。 2)悬浮生长的细胞：可用离心涂片机法制成涂片。 （5）离心涂片机法 制成2×105-6／ml细胞悬液,取50～100μl，加入涂片机内，1000r／min, 2min，细胞即可均匀分布于载玻片上。;（二）免疫组织化学的固定方法;1．浸入法： 组织立即浸于固定液内,时间在2～12h之间。 2．灌注法： 插管由左心室插入主动脉,先用PBS冲洗血液,再 以泵或吊瓶灌注固定液。在灌注后30min内取材, 再置同一固定液内浸入固定l～3h。可使固定液 到达全身各处组织。 3．微波固定： 微波处理后,温度升高,分子运动加快,促进固定 液向组织内渗透,短时间达到固定效果。将标本 放入5～10ml固定液内,置于炉中央,周边放一烧 杯盛400纯水以吸收炉内产生的热量,选择强档照 射10～30s,照后固定液温度≤50℃。取出后,在 相同固定液内再固定2～6h(室温)。;（三）重要固定液;(2) 非醛类固定剂： 为非醛类双功能试剂，单独应用时，边缘固定效应较重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用时，效果明显好转。较适用于多肽类激素的组织固定。 1) 碳化二亚胺液: 适用于含多肽激素组织的固定。 2) 碳二亚酰胺一戊二醛液(ECD—G液)：对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是培养细胞电镜免疫细胞化学的良好固定剂，也常用于多肽类激素固定。 3) Zenker’s液：因含重金属，固定时间要短，以2～4h为宜。染色前必须脱汞。;(3) 丙酮及醇类固定剂： 其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，能够较好地保存抗原的免疫活性。但醇类对低分子蛋白、多肽及胞浆蛋白质的保存效果较差。与冰醋酸、氯仿、甲醛等混合使用，效果可明显改善。 1) 丙酮：常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。保存抗原性较好，穿透性及脱水性较强。 2) 95%乙醇：用于冰冻切片及细胞涂片的后固定。效果较差,和其他试剂混合使用,染色较好。 3) AAF液：较常用的固定液。(95～100％乙醇85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10m1)。 4