第3章动植物细胞培养产酶.pptVIP

第三章 动、植物细胞培养产酶;一、动植物细胞中酶生物合成的调节 1.细胞分化改变酶的生物合成（如端粒酶） 2.基因扩增加速酶的合成 3.增强子促进酶的生物合成 4.抗原诱导抗体酶的生物合成 ;二、植物细胞培养产酶; 植物、动物、微生物细胞的特性比较;2.培养基特点 应用最广的是MS培养基和LS培养基 常用的MS培养基和B5培养基的组成列于P73表3-3;3.培养工艺：——悬浮细胞培养 ⑴工艺流程 外植体→细胞的获取→细胞培养→分离→纯化产物 ①外植体选择和处理 选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇，0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。;外植体： 从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。 愈伤组织： 将上述外植体植入诱导培养基中，于25℃左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。;水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织;②植物细胞获取 直接分离法 愈伤组织诱导法 原生质体再生法 ③细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养 ④分离纯化：生化技术;⑵ 培养条件的影响与控制 ①温度：室温25℃(有时需变温控制） ②pH：微酸性范围。即pH 5.0-6.0 ③溶解氧的调控：通气与搅拌 ④光照的控制：强度和时间有一定要求 ⑤前体的添加（饲喂） ⑥刺激剂的应用;4.植物细胞培养产酶实例 以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（SOD）为例 (1)大蒜愈伤组织的诱导 选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣，去除外皮，先用70%乙醇消毒20s，再用0.1%升汞消毒10min，然后无菌水漂洗3次。 在无菌条件下，切成0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D（二氯苯氧乙酸）和1.2mg/L 6-BA（苄基腺嘌呤）的半固体MS培养基中，在25℃，600lux，12h/d光照条件下培养18d，诱导得到愈伤组织，每18天继代一次。;(2)大蒜悬浮细胞培养 将上述在半固体MS培养基上培养18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠，25℃，600lux，12h/d光照条件下震荡培养10-12d，使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。 然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有3mg/L 2,4-D和1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中，25℃,600lux，12h/d光照条件下震荡培养18d。;(3)酶的分离纯化 细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。;三、动物细胞培养产酶 1.动物细胞培养的特点 动物细胞可以产生各种有效高价值的物质 需添加抗生素（常用青霉素和链霉素联合） 细胞生长速度慢 细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感 反应过程成本高（P81），产品价格贵 细胞具有锚地依赖性（宜采用贴壁培养）和接触抑制性 原代细胞一般繁殖50代;2.培养方式 (1)悬浮培养 (2)贴壁培养 滚瓶培养 微载体培养(microcarrier culture) (3)固定化细胞培养 包埋(entrapment)和中空纤维(microencapsulation)培养 ;3.工艺控制 ⑴工艺流程 种质细胞 （体细胞；杂交瘤细胞） 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养 收集 分离纯化 产物 ;⑵培养条件的影响与控制 ①温度：一般控制在36.5℃. ②pH值：一般控制在7.0-7.6的微碱性范围内。 (需监控和调节，缓冲系统） ③渗透压: 应与细胞内渗透压相同。 ④溶解氧：根据情况随时调节。 （通过混合气体的量和比列调控） ;4.产酶实例 以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例 纤溶酶原 纤溶酶 ;①种质细胞用胰蛋白酶处理，分散，pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 ②接种到反应器中，与37℃ CO2培养箱中，长成致密单层 ③去培养液，用pH7.4磷酸盐冲洗细胞 ④换无血清Eagle培养液(P83)，继续培养 ⑤每3-4天，取出培养液分离纯化 ⑥再加新鲜Eagle培养液，继续培养 ⑦亲和层析进行分离;+;细胞生产滚瓶培养装置;; 第三章小结：; 补充：;;3.酶与底物形成过渡态理论 酶