高效液相色谱剖析11.pptVIP

高效液相色谱的使用及其维护;一 液相色谱的发展史;二 HPLC的原理及特点;二 HPLC的原理及特点;三 液相色谱的分类;四 固定相; 而目前在高效液相色谱的应用中，有80%以上是化学键合固定相的色谱。 化学键合相是利用化学反应将有机分子键合到担体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而构成的。一般用硅胶作担体，采用键合反应有酯化键合（Si-O-C）、硅烷化键合（ Si-O-Si-C ）和硅氮键合（Si-N）。 正相键合色谱最常用的是键合氰基、氨基、二醇基等极性基团的键合相，采用极性固定相、非极性或弱极性流动相，适合于中等极性样品的分离。 反相键合色谱的固定相是非极性，通常拥有疏水的十八硅烷（ODS）或辛烷官能团。如键合C2， C4， C6， C8， C16， C18， C22烷基和苯基等非极性基团的固定相。 ;五 流动相; 正相色谱中，流???相与固定相间的相互作用越强，溶质吸附就越弱，反之亦然。也就是说流动相强度增大，洗脱能力增强。一般采用乙烷、庚烷、异辛烷、苯和二甲苯等有机溶剂作为流动相，有时还加入一定量的四氢呋喃等极性溶剂，即采用多元流动相的分离模式。 反相色谱中，常用洗脱剂有水、乙腈、甲醇和四氢呋喃等。洗脱强度的强弱顺序为：水 甲醇 乙腈 乙醇 四氢呋喃 丙醇 二氯甲烷。 溶剂的极性随溶剂强度的增加而降低。 ;六 液相色谱柱; 色谱柱的维护 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影 响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓； 进样前检查色谱系统的各个接头看是否有漏液现象； 不要把柱接头上得太紧，以免损坏接头螺纹； 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效； 柱子不应放在有气流和阳光照射的地方，气流和阳光都会使柱子产生温度梯度而造成基线漂移； 不要使其碰撞，以免柱床因震动产生空隙或通道。; 反相色谱柱应将柱内充满乙腈或甲醇来保存，通常用20倍柱体积（50-60ml）冲洗。柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间； 柱子失效通常是柱端部分，在分析柱前装一根与分析柱相同固定相的短柱（5-30mm），可以起到保护、延长柱寿命的作用。 ;六 HPLC的使用与维护; 每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器，再以水清洗。 C18柱绝对不能进蛋白样品，血样、生物样品。 堵塞导致压力太大，按柱子→预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查并清洗。 要注意柱子的PH值范围（2-8），不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 更换流动相时要先将流速降到零，不要在有流速的状态下将滤头置于空气中；另外更换时应先将滤头部分冲洗或放入烧杯中边振动边清洗，然后插入新的?流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。 ;;七 HPLC的使用常见问题; 出现负峰，用示差检测器时，样品的折光指数小于流动相溶剂的折光指数；或流动相不纯净；用UV检测器时，溶解样品的溶剂与流动相溶剂不能互溶或PH值不同，当光在两种互不相溶的溶剂界面产生折射，从而使光电池受到不同强度的光，光强度减弱，以至于低于参比而出现负峰。 样品前处理，最好使用流动相溶解样品，用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质；进样前清洗进样针和进样阀。 剩余流动相的处理，有机相要是高纯的，用完了剩下的密封起来就行了，时间不限；水相或者缓冲盐的，最多放48小时，再用不完就应废弃；有机相和水相混合的有机相超过50％的用剩下的可以4度保持，但最多一周。此外，流动相一定要贴标签注明;感谢您的关注