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核酸分子杂交技术与应用
第九章 核酸分子杂交技术与应用; 第一节 杂交的基本原理一、核酸分子杂交的基本原理与分类(一)核酸分子杂交的基本原理1、变性(denaturation)(1)定义: 在一定的条件下,双螺旋之间氢键断裂,双螺旋解开,形成无规则线团,双链解链成为单链。;(2).引起核酸变性的因素;(3)、变性核酸的特点: 粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加 ;2、融解温度:定义:在DNA热变性时,其A260的升高达最 大值一半时的温度。 ;;影响Tm的因素: (1) DNA碱基的组成 G-C含量越多 Tm值越高 A-T含量越多 Tm值越低;(2)溶液的离子强度 低离子强度 Tm值越低 高离子强度 Tm值越高;3、复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。影响复性速度的因素: DNA浓度 DNA片段的大小 DNA片段复杂性 合适的复性温度 适当的离子强度;;4、杂交 ; ; ;二、核酸探针(一)探针的概念 探针(probe) 指能与特定靶分子发生特异性相互作用,并能被特殊方法所检测的分子。 例如抗原-抗体、生物素-亲和素等均可看成是探针与靶分子的相互作用。基因探针 指能与特定核苷酸序列发生特异互补杂交,杂交后又能被特殊方法检测的已知被标记(同位素或非同位素标记)的核苷酸链。;(二)探针种类和选择1.探针种类(1)基因组DNA探针 为某一基因的全部或部分序列,或某一非编码序列。(2)cDNA探针 以mRNA为模板经逆转录酶催化产生的互补于mRNA的DNA链。 (3)RNA探针 以DNA两条链中的任意一条为模板转录生成RNA。具高杂交效率,但易于降解和标记方法复杂。(4)寡核苷酸探针;2.探针的选择 高度特异性,一般探针越长,杂交作用越强,其专一性也越强。 ?;三、探针标记原理与方法 理想的探针标记物应具备①高度的敏感性 ②标记物与探针结合后,不影响杂交时碱基 配对及探针分子的主要理化性质;③检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳 性绿低外,尚需考虑环境污染少,价格低;④若用酶促方法标记,应对酶的Km值影响不 大,以保证标记反应的效率和标记产物的 比活性。;(一)、标记物 放射性同位素标记物 非放射同位素标记物; 1.放射性同位特点: ●放射自显影技术检测,信号的强弱通过 计数银粒的多少易于进行定量分析。主要缺点 射线对人体有伤害 放射性物质需特殊的处理 半衰期短不宜存放使用 ;2. 非放射性标记物 常用的有地高辛(digoxigenin,Dig)、生物素(biotin)、荧光素。特点: 敏感性不如同位素标记 稳定性和分辨率高 检测时间短 操作简便 不需特殊的防护设备 不存在放射性污染;(二)放射性同位素标记法探针标记法 酶反应法 化学反应法常用标记探针的同位素 32P 3H 35S 131I 125I 14C; 全程标记1、随机引物法(random priming) 利用DNA聚合酶来合成与模板互补的新的DNA链。 将6-8寡核苷酸片段与已变性的DNA单链或RNA模板退火,使该片段随机互补结合在单链分子上,在大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段作用下,以同位素标记的dNTP为原料,寡核苷酸为引物的3’-OH端开始沿5’至3’方向,合成一条与模板互补的新DNA链。;; 2、切口平移法◆胰DNA酶I在DNA双链上随机切开若干切口, 切口处形成3’-OH末端。◆大肠杆菌DNA聚合酶I以切口处开始作用, 以另一条DNA链为模板。◆4种三磷酸脱氧核苷酸为原料,沿切口 水解5’端核苷酸和3’端修复加入标记核苷 酸同时进行,切口平行推移。 生成的两条链都被同位素均匀标记。;大肠杆菌DNA聚合酶I(1)5’ 3’聚合酶活性;(2)3’ 5’外切酶活性;(3)5’ 3’外切酶活性;;3、全程RNA探针标记4、化学法全程标记; 末端标记法 末端标记法是将标记物导入线型DNA或RNA的5’端或3’端的一类标记法。? 5’端标记法 3’端标记法;(1)5’端标记法
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