蛋白质与酶工程第三章酶的分离纯化层析试题.ppt

酶的分离纯化 离心技术;第四章 层析技术;引言;层析法的基本原理;层析法的分类;引言;1906年俄国植物学家茨维特（Michael Tswett）: 将碳酸钙细粉装入玻璃瓶， 石油醚抽提叶子的色素溶液倾入， 接着倒入石油醚洗涤， 柱上部出现了绿色的叶绿素， 中间是黄色的叶黄素， 而在下面则是胡萝卜素橙黄色 色带叫作“色谱”， 方法叫色谱法（Chromatography), 层析法 。;概念:;1905-1930. Who cares! Why？ 1931年德国库恩(Kuhn)重复了茨维特实验, 用氧化铝和碳酸钙分离了α-,β-,和γ-胡萝卜素，此后用这种方法分离了60多种这类色素，1938年他从维生素?B?中分离出?B?6. 1938年的诺贝尔化学奖。;相同时期发生在中国大地的事件;1941年生物化学家Martin（马丁）和Synge（辛格）把色谱法应用于氨基酸的分离。 将淀粉作为色柱里的填料:淀粉色谱法 滤纸作为载体: 纸色谱法;塔板理论;分配系数, partition coefficient:在平衡状态下，组分在固定相中的浓度和在流动相中的浓度之比. 例: 将MgCl2溶解于辛醇和水的混合液体, 分别测量MgCl2在辛醇和水中的浓度,计算比值. 好溶解的分配系数小, 不好溶解的分配系数大. ;1952年，马丁同詹姆斯(James)，把LLC技术原理应用在分离气体上。 各种气体或蒸汽的混合物利用氮或氦一类情性载气的气流通过吸收性固体的表面。混合的气体通过后,在另一端出现时就分开了。;高效液相色谱(HPLC)的应用;液相色谱与气相色谱法比较 ;层析法的基本原理; （1）按流动相状态分类： 　液相色谱 液-固层析 　　 液-液层析 　气相色谱 气-固层析 气-液层析;（2）按层析原理分类： 吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能 的差异，达到分离鉴定的目的。 分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间 的分配系数（或溶解度）不同。 离子交换层析:利用不同组分对离子交换剂亲和 力的不同。 凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组 分阻滞作用的不同。 ;（3）按操作形式不同分类： 柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方 向移动而达到分离。 纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流 动相展开，以达到分离鉴定的目的。 薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，类 似纸层析。;层析技术;第一节 吸附层析技术;吸附柱层析 　　吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱状的一种层析方法。 　　常用的吸附剂有羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石和活性炭等。 　　这种层析方法已成为科研、医学、化工及发酵等部门常规使用的一种分离手段。;吸附柱层析 一、常用术语 1.层析：以基质为固定相（柱状或薄层状），以液体或气体为流动相，有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行分配、吸附、交换作用，最终结果是使混合物得到分离。;吸附柱层析 一、常用术语 2.洗脱体积（Ve）： 是指某一成分从柱顶部到 底部的洗脱液中出现浓度 达到最大值时的流动相体积。;;第一节 吸附层析技术;薄层层析(TLC) 　　薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。 　　薄层层析可根据固定相的种类分为吸附薄层层析（吸附剂为固定相）、分配薄层层析（固定在支持剂上的水溶液或有机溶剂为固定相）和离子交换薄层层析（离子交换剂为固定相）等。;薄层层析 薄层层析的优点： 1.展层时间短，薄层层析分离混合物一般 仅需15-60min； 2.设备简单，操作方便，既适用于分析，也适用于制备； 3.灵敏度高。;;薄层层析;纸色谱法;吸附TLC;;第三章 层析技术;第二节　分配层析技术;（分配TLC，纤维结构，固定相是纤维-水）;第四章 层析技术;第三节 凝胶过滤层析技术;原理：凝胶颗粒为多孔网状结构。 混合物流过时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来；比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。;固定相与流动相： 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，流动相是流动的洗脱液。 排阻极限： 指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。排阻极限为30000表示30000Da的分子将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。 3. 凝胶颗粒大小常以目数(mesh)或者颗