2_酶谱法检测血清基质金属蛋白酶MMP_2、MMP_9的活性.pptVIP

酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9活性; ;第一部分，电泳技术简介; ;影响泳动率u的因素 内因：1.净电荷：电荷愈多愈快 2.粒子大小：颗粒直径愈小愈快 3.粒子形状：愈接近球形愈快 外因：1.V ( U/L)：电场强度越高电泳速度越快 2.缓冲液的pH (pH恒定)： PH值决定带电颗粒的解离程度，决定物质所带净电荷的多少 3.离子强度[I] 最适:0.02-0.2 缓冲液的离子强度越高，电泳速度越慢 4.电渗：液体对固体支持物的相对移动，应尽量避免选用有电渗作用的支持物;按支持介质的不同可分为：纸电泳（Paper electrophorisis）醋酸纤维薄膜电泳（Cellulose Acetate electrophoresis）琼脂凝胶电泳（Agar Gel electrophoresis） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide Gel-electrophoresis） SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法） 按支持介质形状不同可它为： 薄层电泳 板电泳 柱电泳 ;电泳设备;水平电泳系统;聚丙烯酰胺凝胶电泳原理;聚丙烯酰胺凝胶有下列特性： 在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好； 化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶； 对pH和温度变化较稳定； 几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好； 样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g； 凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径； 分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。;SDS－PAGE的原理;不同分子量的蛋白质在凝胶中运动示意图;不同聚丙烯酰胺凝胶浓度对不同分子量的 蛋白质混合物分离能力的关系;第二部分，酶谱法检测血清中基质金属蛋白酶MMP-2和MMP-9的活性;肿瘤细胞的侵袭移动;细胞间基质结构示意图;肿瘤细胞的侵袭是需要与细胞增殖、分化、移动的相关基因及其表达调控模式的改变和促进细胞移动的外界因素两者的共同作用。 虽然肿瘤细胞侵袭的分子机制还不是十分清楚，但已发现许多调控细胞侵袭转移的关键分子及其信号通路。 肿瘤细胞通过其表面受体与ECM中的各种成分粘附后激活或分泌蛋白降解酶类来降解基质，从而形成局部溶解区，构成了肿瘤细胞转移运行通道。一般恶性程度高的肿瘤细胞具有较强的蛋白水解作用，可侵蚀破坏包膜，促进转移。目前较为关注的酶主要是丝氨酸蛋白酶类，如纤溶酶原激活物(plasminogen activator, PA)和金属蛋白酶(metalproteinase, MMP)类，如胶原酶IV、基质降解酶、透明质酸酶。 ;MMPs家族成员根据其在细胞中表达部位的不同，分为胞质型和膜型两大类。前者分布在胞质中，后者表达在膜上。胞质型MMPs根据其作用底物的特异性、敏感性及氨基酸序列的同源性分为三大类： （1）间质胶原酶，包括MMP-1、MMP-5、MMP-8、MMP-13，其作用底物主要为间质胶原, 即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ、Ⅹ型胶原, 但不能降解明胶和Ⅳ型胶原； （2）明胶酶，包括MMP-2和MMP-9,其作用底物主要是Ⅳ型胶原和明胶，还可降解Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ型胶原,但不能降解间质胶原； （3）间充质溶解素，包括MMP-3、MMP-7、MMP-10和MMP-11，其作用底物主要是基质中的蛋白多糖和糖蛋白，如纤维粘连蛋白(FN)、层粘连蛋白(LN)，间充质溶解素对胶原的作用不同于间质胶原酶和明胶酶，它们能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅷ、Ⅹ型胶原酶以及Ⅰ型胶原的氨基端。 通过影响细胞外基质，基质金属蛋白酶蛋白家族参与胚胎发育、形态发生、组织重塑等过程，并参与炎症、肿瘤、心血管、神经等许多疾病过程。 ;MMP-2又叫明胶酶A， 其蛋白主要由纤维结缔组织细胞和肿瘤细胞产生，分子量为72kDa。 MMP-9又称为明胶酶B，主要由单核细胞、巨噬细胞多形核白细胞和肿瘤细胞产生。分子量为92kDa，是MMPs中分子量最大的酶。 中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白（neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL)是1993年Kjeldsen等人在研究MMP-9在细胞内存在形式时发现的，它能够与MMP-9聚合形成异源二聚体，保护和调节MMP-9活性，从而促进恶变细胞的浸润和转移。 检