细胞工程精华课件 十、胚胎工程.ppt

第十章 胚胎工程;胚胎工程（发育工程）;第一节　配子操作 第二节　胚胎操作;一、精子 二、卵母细胞 三、体外受精;一、精子;精液的采集;台畜;假阴道组成图;假台畜;;精液的保存;保存方法 常温保存（15～25℃）：主要通过降低pH值达到抑制精子的代谢活动，一般可以保存2天以上。 低温保存（0～5℃）：主要是抑制其正常的代谢活动，除猪外，其它家畜的保存效果均较好。 超低温保存（-79℃～-196℃）：可以在液氮中长期保存精液，用时可以即时解冻。 对于不同的动物，各种保存液的配制方法都有所差异的。;精子的体外获能;二、卵母细胞;超数排卵（superovulation） ;采卵;对于屠宰场中的大中型动物，可以用注射器插入卵泡中抽取，或在手术后暴露卵巢，以注射器自卵泡中取卵。 对人而言通常在超数排卵步骤处理后，用B超检测卵巢表面卵泡发育情况，然后，在腹腔后部体??进行局部麻醉，将腹腔镜望远镜插管插入，以观察卵巢表面卵泡成熟情况，然后用套有聚四氟乙烯套管的吸卵针将卵吸出，放平皿中检查。;卵母细胞一般检测;原始卵泡;镜检卵母细胞;三、体外受精;历史;方法 ;常规体外受精技术;显微受精技术;卵母细胞质内注射：是将整个精子或精子头部直接注射到卵母细胞质内。要求注射针的尖端必须锋利，注射吸管内径通常为5-10μm，并尽量避免液体进入卵胞质。此方法可以使任何类型的精子如精子头形不正常、死精子或严重缺陷的精子等进入，可省去获能和顶体反应。 透明带下注射：将1个或多个精子注入透明带下，可以一步直接将精子注射到卵周隙。 也可以先将透明带钻孔或部分切口后，再进行精子注射。;如果在透明带上人为钻孔后，可以为精子入卵提供机会，或者是易于精子入卵。可以先用固定吸管固定住卵，然后将吸满酸性台氏液（pH2.5）的微吸管沿卵外周切线方向往透明带上射出稳定的液流。当透明带上溶出小孔后，即可撤走注射针。将卵洗涤后，再用适当密度的精子进行受精。 　　先用胰麋蛋白酶软化透明带，然后用纤细的针在透明带上扎针孔，本法适用于精子运动乏力或少精症不育患者的治疗。通过该技术已经使得小鼠获得了超过30％的妊娠或出生率，而且并没有增加孤雌活化率和多精受精率。 另外，可以用微细玻璃针或金属微刀片，在透明带上切开或挑开或撕开一个口，再经适当浓度精子受精。;受精卵的体外培养 ;目前，克服阻滞现象主要采用以下两个方法： 一是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分； 二是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。 ;体外受精的意义;第二节　胚胎操作;一、胚胎培养;培养方法;输卵管培养法：取发情动物的输卵管洗涤后，置于培养皿中，培养液面超过输卵管，将同种或异种动物的胚胎自伞口注入输卵管，进行培养。 中间受体培养法：是指操作后的胚胎，可将受精卵或早期胚胎移入同种或异种动物的胚胎，该方法没有种属特异性，但为了在培养后容易找到胚胎和对胚胎的保护，一般先用琼脂包埋后再培养。;胚胎活性评价法;二、胚胎移植;胚胎移植的基本程序 供体、受体的选择 超数排卵 同期发情 人工受精 胚胎采集 胚胎活力的检测 胚胎移植 移植后的检查;1．供体、受体的选择;2．超数排卵;3.同期发情;4．人工受精;5．胚胎采集;（2）非手术回收法：借助采卵器从阴道到达子宫采集胚胎 ;6.胚胎活力的检测;7.胚胎移植;手术法移植;非手术法移植;选择;发挥优良母畜的繁殖力，迅速扩大优良畜种数量，加速优良畜种的推广应用； 缩短世代间隔，增加选择强度，促进家畜改良速度； 长期保存冷冻胚胎，便于优良品种的种质运输和保存； 是胚胎分割、胚胎嵌合、性别鉴定和核移植等其它胚胎生物技术的基础，也是基础生命科学研究的重要手段。 ;三、胚胎保存;1.异种动物体内保存法;琼脂包埋移植法是指将胚胎移植到1％的琼脂液中，用口径适宜的微吸管把胚胎连同少量琼脂液一起吸入。当琼脂凝结后再将其压出，胚胎就被封入圆柱形琼脂小柱中，每个琼脂小柱放3-5枚胚胎，再把这个琼脂小柱封入较大的1.2％琼脂圆柱内。然后，通过胚胎移植技术，将琼脂柱移入中间受体输卵管中。移植前，预先结扎输卵管与子宫的接合部。;2.37℃保存法;3.冷藏保存法 ;4.冷冻保存法;冷冻过程中细胞受到的损害;防止冷冻损伤;动物胚胎的一般保存程序;超低温冷冻保存方法;一步冷冻法省去了洗脱冷冻保护剂，其主要特点是冷冻细管里的冷冻液和稀释液是分开的。细管里装有培养液、含胚胎的冷冻液、稀释液。该法适用于冷冻胚胎运输使用。 快速冷冻法将胚胎或卵母细胞在适当的冷冻保护剂混合液中作短暂处理后，直接投入液氮。 玻璃化法简单、快速而有效，不需要冷冻仪，主要依靠溶液的玻璃化特