细胞工程精华课件 六、细胞融合与杂交瘤技术.ppt

第六章 细胞融合与杂交瘤技术;第一节 细胞融合技术 第二节　杂交瘤技术与 　　　　单克隆抗体的生产;第一节 细胞融合技术 一、细胞融合概述 二、细胞融合的基本原理 三、细胞融合的常用方法 四、融合细胞的筛选;1. 定义 细胞融合（cell fusion)，又称体细胞杂交（somatic hybridiazation），是指两个或多个相同或不同细胞通过膜融合形成单个细胞的过程。;;2.发生： ;Muller于1838年观察到脊椎动物的肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。 Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。 Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。 Lange于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。 Cienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在无脊椎动中发现了细胞合并现象。 1958年日本学者冈田善雄发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。 1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。 1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌预定单克隆抗体的杂交瘤细胞。 20世纪80年代出现了电融合技术。;生物种类;植物融合细胞成长状态对比，右瓶为地面融合的细胞，左瓶中为太空微重力环境下融合的细胞。;动物细胞融合实验使用的小白鼠 ;4. 细胞融合的分类;5. 细胞融合过程 分四个阶段： 细胞接触→细胞质膜的融合→细胞质重组→遗传物质的选择;植物细胞融合过程;6. 细胞融合的意义;二、细胞融合的基本原理;显微镜下细胞融合过程;融合过程中两个细胞膜从彼此接触到破裂形成细胞桥的变化过程图解;三、细胞融合的常用方法;细胞融合技术分类： ;1. 生物法——仙台病毒法;用灭活的病毒诱导的动物细胞融合过程示意图; 原理： Kao等认为，由于PEG分子具有轻微的负极性，故可以与具有正极性基团的水、蛋白质和碳水化合物等形成H键，从而在在质膜之间形成分子桥，其结果是使细胞质膜发生粘连进而促使质膜的融合；另外，PEG能增加类脂膜的流动性，也使细胞的核、细胞器发生融合成为可能。 ;影响因素：;PEG诱导融合的特点：其优点是融合成本低，勿需特殊设备；融合子产生的异核率较高；融合过程不受物种限制。其缺点是融合过程繁琐，PEG可能对细胞有毒害。?;聚乙二醇（PEG）法细胞融合过程;;聚乙二醇（PEG）法细胞融合步骤 将两种不同亲本细胞各5×l06混匀； 离心沉淀，吸去上清液； 加1ml 50％PEG溶液，用吸管吹打，使之与细胞接触1分钟； 加9ml 培养液，离心沉淀，吸去上清液； 加5ml 培养液，分别接种5个直径60mm平皿，每个平皿加培养液至 5ml，37℃的CO2培养箱中培养。 6—24小时后，换成选择培养液筛选杂交细胞。;3.电融合法;电融合的基本过程： 细胞膜的接触：细胞在交变电场中极化并沿电力线排列成串，形成细胞间的紧密连接； 膜的击穿：在高强度、短时程的直流电脉冲作用下，在其膜上会短暂地形成小孔，从而导致两个紧密接触的细胞融合在一起。 ;;;;甜菜原生质体电融合过程;4. 不同细胞融合的条件及其主要应用;;融合后的柑橘;融合柑橘与母本比较;原理：两种亲本细胞融合的混合物中可能有多种类型细胞，筛选的目的是获得优良的杂种细胞。 1）亲本 2）同核体 3）异核体;抗药性筛选系统：利用生物细胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 　如，亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉素不敏感 　　　亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉素不敏感 　　　杂种细胞可以在含有两种抗生素的培养基上生长;HAT选择系统;HAT选择培养法;营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。 　如，亲本A：色氨酸缺陷型 　　　亲本B：苏氨酸缺陷型 　　　杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。;温度敏感突变型：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 　如，亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。 　　　亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。 　　　杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。;荧光激活细胞分选仪：用不同荧光素标记的脂质染料分别处理参与融合的亲本细胞，在激光的激发下，融合细胞能发射两种荧光，由此筛选杂种细胞。 　如，亲本一：用RB200标记，发明亮橙色荧光。 　　　亲本二：用FITC标记，发黄绿色荧光。 　　　杂种细胞能发射两种荧光。;;2. 杂交细胞表