新型实时定量PCR简介.ppt

Real-time Quantity PCR;实时定量PCR简介;实时定量PCR的两个重要概念;作用原理;SYBR　GREEN ;1.TaqMan探针方法的作用原理: 本方法的原理主要是利用Taq?酶的5→3外切核酸酶活性并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记探针。TaqMan探针5端标以荧光发射基团，3端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭基团抑制5发射基团的荧光发射。在PCR的退火期。探针与引物所包含序列内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引物在Taq酶作用下延DNA模板延伸，当到达探针处，Taq酶发辉5→3外切核酸酶活性，继而发生置换。切断探针后，发射基团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。这时荧光探测系统便会检测到光密度有所增加。模板每复制一次，就有一个探针被切断，并伴有一个荧光信号的释放。由于理论上被释放的荧光基团数目和PCR产物数量是一对一的关系，且光密度同释放的荧光基团的数目也成正比关系，因此该技术可对模板进行准确定量。由于扩增产物较短时效率较高，故扩增长度一般为50—150bp。 ;;探针设计一般应符合以下条件：? (1)GC碱基含量在40%-60%。 （2）?避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 （3）避免5端为G，?因为G对荧光可能有抑制作用，尽量使C个数多于G。 （4）长度应在15--25个碱基左右，以保证结合的特异性。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10℃。 另外，探针与引物不能形成二聚体，?位置与上游引物尽量接近但不要重叠。 ;(2)?SYBR?Green?I荧光染料的作用原理 ;;(3)LUX?引物 ; ????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????? 图.LUX 引物工作原理 ;Lux引物;LUXTM 技术的优势;Invitrogen qPCR产品;qPCR 试剂盒;(3)RNA UltraSense One-step Quantitative RT- PCR System 适用于超低量RNA摸板的灵敏扩增的QRT-PCR??统 (4)Platinum qRT-PCR Thermoscript One-step System 适用于扩增具有二级结构的RNA ;(2) 适合于其他系统 ① Superscript Ⅲ Platinum one-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum SYBR Green one-step qRT-PCR Kit (3) Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect 二步法 ① Superscript Ⅲ Platinum CellsDirect Two-step qRT-PCR Kit ② SuperScript Ⅲ Platinum CellsDirect Two -step qRT-PCR Kit w/SYBR Green