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2003秋季高级生化技术教程; 细胞培养技术 与 单克隆抗体技术 水生所： 张 奇 亚 ;一、 细胞培养技术  （一）简介与回顾;一、 细胞培养技术  （二） 基本概念;一、 细胞培养技术  （二） 基本概念;一、 细胞培养技术  （二） 基本概念;无菌室 超净工作台恒温培养箱 离心机例置相差显微镜　　　 水浴箱、解剖剪 　　 镊子（尖头、平头和有钩镊）烧杯　　　　 培养瓶离心管　　　　　 吸管细胞记数板　　　　　 酒精灯 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （三）设备和器皿 ;一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤;一、 细胞培养技术  （四）方法与步骤;2、动植物细胞的培养例一：例一 乳鼠肾细胞原代培养 准备工作 A． 培养用品消毒后，安放在超净工作台内， 紫外线消毒，做好洗手等准备工作. B． 点燃酒精灯，用品按布局放置，安装吸管等;a 采用颈椎脱臼法，将一只新生乳鼠处死b 将小鼠进入盛有酒精的烧杯中数秒 c? 置超净工作台内;a 打开消毒器械包 用镊子掀起乳鼠腹部皮肤,用解剖剪剪开腹腔,充分暴露腹腔b 用另一镊子轻轻夹起肠管,翻置一侧,充分暴露位于腹腔背壁脊柱 ;a 取下双侧肾脏,放入消毒培养皿中b 用吸管吸取PBS加入培养皿中,清洗肾脏3次,尽量去掉血污. c 将肾组织用解剖剪剪成几块，再用PBS漂洗，去净血液为;胰蛋白酶消化 将洗净的组织块移入消毒小瓶中,用眼科剪剪切至0.5mm大小的组织块。 加入5-8倍体积的0.25%胰蛋白酶，盖好放入37℃水浴中消化20-30分钟,注意应每隔5分钟振摇一次。 当组织块变得疏松,颜色???白时，取出置于超净工作台内用吸管反复吹打组织块,使大部分组织块分散成细胞团或单个细胞状态 加入1-2ml培养液终止消化，净置片刻，让未消化完的组织块自然下沉,将上部的组织悬液移入无菌离心管中。;离心及计数  以800-1000转/分离心8-10分钟,超净工作台内开盖,取上清加入适量培养液,细胞计数后分装； 在细胞瓶(板)上标明细胞名称，代数，日期； 倒置显微镜下观察细胞分散情况后置37℃孵箱中培养;细胞观察 培养细胞每天观察，检查：A.污染与否? B.细胞生长状态 如见培养液变为黄色且又混浊，为污染;如培养液为桔红色，表明细胞状况良好。在无污染时，24h内有细胞贴壁，圆形悬浮状的细胞延展成短梭状。 培养3-4天，细胞生长繁殖，可见细胞岛形成。细胞透明，颗粒少，界线清。 由于细胞生长旺盛，代谢产物堆积，CO2增多，培养液逐渐变酸呈黄色，但液体澄清，此时应换液。 ;2、动植物细胞的培养例二： 例二 鱼类细胞培养 鱼类原代细胞的培养 A 断尾（或剪腮）放血 B 用0.01％高锰酸钾溶液或70％的乙醇浸泡消毒30分钟。 C 70％酒精棉球擦洗解剖部位 D 剖开腹腔，取出组织，清除粘膜和血液，剪碎， 维持液(Hanks液)或缓冲液(PBS)洗。 E 用0.25％胰酶消化(20℃，30’或4℃， 过夜) F 离心(1000rpm, 10’), 弃去消化液。 G 用培养基重悬，计数，分装培养(应在2x104个细胞/ml 以上)。 当原代细胞长成单层后，即可进行传代培养。? 传代细胞的培养 A 长成单层的细胞弃去培养基，加胰酶－EDTA，消化后弃去消化液 B 加培养基，吹打分散 C 分装培养 ?;;;;甲醛固定法用于?细胞固定，适应于一般培养细胞的固定操作步骤：?1、用PSB洗  2、加固定液  3、处理5分钟  4、用PSB洗 伊红(结晶紫)染色用于普通细胞染色，操作步骤: ?1、用甲醛法固定细胞  2、配染色工作液