第五章_植物细胞培养与次级代谢产物制备.ppt

细 胞 工 程;第五章 植物细胞培养;第一节 植物细胞培养的特点;植物细胞培养基成分丰富而复杂，适合微生物生长，因此防止污染更困难。 植物细胞培养一般需要光照，通过光合作用合成有机物，因此氧气和CO2的含量与传递对细胞培养影响较大。;与微生物细胞相比，植物细胞有什么特点？;第二节 植物细胞培养技术;（1）单细胞分离; 酶解法;由愈伤组织诱导分离单细胞;摇床用于振荡;（2）植物单细胞小规模培养;看护培养概念：用一块愈伤组织或植物离体组织看护单细胞使其生长增殖的一种单细胞培养方法。;饲养层培养将饲养细胞先用射线辐射处理，使其失去活性，然后将饲养细胞和培养细胞混合植板，经过照射的细胞对于培养细胞能够起到一个饲养作用。;双层滤纸植板培养方法;概念：将制备好的单细胞悬浮液，按照一定的细胞密度，接种在1mm左右的薄层固体培养基上进行培养，称之为平板培养。?;微室培养概念：人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称微室培养。;微室培养特点：①能在显微镜下追踪单细胞分裂增殖形成细胞团的全过程。②培养基少，营养和水分难以保持，pH值变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。; 细胞同步化是指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 同一培养体系中，细胞不同步使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理、生化状态等更趋复杂化，所以人们一直希望通过一定的技术途径，使同一培养体系中的细胞能保持相对一致的细胞学和生理学状态。;①体积选择法：用大、小孔径筛网过滤、收集单细胞。 ②冷/低温处理法：4℃低温下处理几天使细胞同步化后，再添加新的培养液培养。 ③饥饿法：控制营养液浓度，通过饥饿使细胞达到同步化，再添加营养液培养。 ④抑制法：使用抑制剂如尿苷、5-氟脱氧尿苷、秋水仙素等使细胞达到同步化。;无论何种细胞同步化处理，对细胞本身或多或少都有一定的伤害。 如果处理的细胞没有足够的生活力，不仅不能获得理想的同步化效果，还可能造成细胞的大量死亡，因此在进行同步化处理之前，细胞必须进行充分的活化培养。 用于处理的细胞系最好处于对数生长期。;细胞系和细胞株;通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养细胞称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用细胞系单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。;细胞株筛选 1、适合于工业化生产的细胞株必须满足以下条件： （1）分散性好，适合大规模悬浮培养。 （2）均一性好，细胞大小、生理状态一致。 （3）生长速度快 培养周期短 不易染菌。 （4）目标产物含量高，容易分离提取。 （5）细胞遗传稳定。 2、适合工业生产用细胞株的一般筛选流程：（自学） 3、细胞株定向富集驯化 4、人工诱变筛选; 5、细胞株保存 ⑴继代培养保存法 悬浮培养的细胞通过每隔1—2周换液进行一次继代培养。这种方法适合于短期保种。 ⑵低温保存法 一般选择5--10℃的温度下培养，每隔十天左右更换一次培养液。 ⑶冷冻保存 包括低温保存（-20℃）、超低温保存（液氮-196 ℃）。;植物细胞大规模悬浮培养(cell suspension culture);意义/优点;Cell suspension;细胞悬浮培养起始培养物的建立;建立细胞悬浮系;悬浮细胞的生长与增殖;悬浮培养细胞数目的增殖变化;细胞生长各个时期的特点：滞后期（延迟期）: 细胞很少分裂，其长短与接种量、大小和继代时原种细胞所处的生长期有关； 对数生长期:细胞分裂活跃，细胞数目增加，增长速率保持不变直线生长期:细胞生长和发育最明显的时期缓慢期:生长逐渐缓慢,培养液消耗将尽，有毒代谢物质增多，氧气减少； 静止/平台期:生长几乎处于停止状态，细胞数目增加极少，甚至开始死亡。衰亡期：细胞死亡速度加快，细胞开始快速自溶，死亡。;成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生长量一般2～3天甚至更短时间便可增加一倍。 ;影响悬浮细胞生长的因素： ?起始愈伤组织的质量：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 ?接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟。 ?培养条件：方式、温度、继代周期;植物细胞悬浮培养的