组蛋白修饰的研究方法.docx

组蛋白修饰的研究方法 一、背景 ? 许多组蛋白的各种翻译后修饰（PTM）（即甲基化，乙酰化，泛素化和SUMO化）发生在赖氨酸位点。虽然在被覆盖的组蛋白折叠域内发现了少数的修饰位点，但是翻译后修饰在柔韧的N-末端尾部区域却是相当普遍的。许多组蛋白修饰能够调节染色质结构中重要的功能性变化，并通过直接地改变染色质结构/动态变化或通过招募组蛋白修饰蛋白和/或核小体改构复合体来实现。 ? 组蛋白翻译后修饰已经被发现能影响许多基于染色质的反应，包括转录，异染色质的基因沉默和基因组稳定性。由于能影响到整个转录程序，与基因表达相关的修饰尤其具有特殊意义。在多种体外模型中，组蛋白翻译后修饰代谢途径的缺陷与基因表达失调有关。这在某些情况下也与人类疾病相关，并已在免疫缺陷和各种人类癌症中得到验证。因此，组蛋白标志物是如何被调节的以及如何影响PTM-特异性结合蛋白的相互作用将继续成为重大的研究领域。 ? 确定组蛋白翻译后修饰的功能往往涉及到研究修饰的丰度和结合伴侣。这里所描述的方法将对这些方面进行总结,其中包括了详述组蛋白纯化方法、制备位点特异性修饰的重组组蛋白、基于多肽的PTM结合蛋白表征体系以及染色质免疫共沉淀样品不同分析手段的实验方案的总结。 二、组蛋白修饰的研究方法 ①细胞裂解 ? 通过免疫印迹来检测组蛋白修饰时可以用经SDSLaemmli样品缓冲液提取得到的全细胞裂解液。对于动物细胞株而言，离心得到的细胞可以直接在样品缓冲液中重悬并煮过后上样; 然而需要注意的是，一些实验方案中还会推荐在提取步骤后对样品进行超声处理。除了碱性预处理步骤是可选的以外，真菌蛋白提取物可以用同样的方式来进行准备。然而，如果实验上必须尽量减少样品处理时间的话该步骤是可以省略的。只要注明该步骤的省略以及后续实验样品均以同样方式处理即可。提取之后再通过离心除去样品中的不溶性组分，将可溶性的全细胞提取物留在上清中。 ②组蛋白富集 ? 在一些实际应用中，有必要检测富集有组蛋白的组分或纯化的组蛋白；富集的样品可以是分离得到的细胞核或者是染色质的粗提取物。从后生动物细???或者酵母中提取细胞核十分简单，基本上只需要三个步骤：低渗膨胀（酵母要先将细胞壁消化掉以后）、利用机械力剪切进行细胞膜裂解（例如用杜恩斯匀浆器进行破碎或者在旋涡混合器上温和震荡）和通过离心分离细胞核（图1A）。染色质粗分离也是很简单的，只要在去垢剂裂解步骤后用离心将染色质沉淀即可（图1B）。 ③组蛋白纯化 ? 一些现有的组蛋白纯化实验方案是相当好的，并且易于遵循。在这里介绍的方法中，组蛋白是使用稀硫酸溶液从细胞核中提取的，然后通过柱层析纯化（图1C）。此方法的优点在于核酸和许多非组蛋白由于在酸性pH值下是不溶的，可以很容易地通过离心来去除掉。可溶的含有组蛋白的组分就可以用三氯乙酸（TCA）来沉淀，并且如果需要的话，可以通过一个反相高效液相色谱柱的方法来纯化。这样提取出来的组蛋白，可用于多种应用，包括免疫印迹和质谱。 图 1.分离完整细胞核（A）,准备原始的染色质部分（B）,纯化组蛋白（C）的实验步骤。 ④组蛋白翻译后修饰的检测 ? 组蛋白的翻译后修饰一般是通过抗体检测的。抗PTM抗体的质量和特异性，应在实验应用之前仔细评估。要考虑的问题包括：其它组蛋白修饰位点的交叉反应、对未修饰（重组）蛋白的识别以及与核中其它物质的交叉反应。这种类型的评价程序也非常简单，涉及到对核提取物进行针对于重组组蛋白的免疫印迹或对点在硝化纤维膜上的一组修饰过的和未被修饰过的多肽进行免疫印迹。 ⑤组蛋白翻译后修饰结合伴侣的表征 - 免疫共沉淀（CoIP）/pulldown实验 ? 当感兴趣研究一个蛋白质与内源性组蛋白之间的相互作用时，有必要先用微球菌核酸酶(MNase)将染色质消化成单核小体大小的片段。感兴趣的蛋白可以从可溶性的含有染色质的组分中免疫共沉淀下来，然后通过免疫印迹来评价与核心组蛋白的结合以及和不同组蛋白修饰的关联。利用已经在含有核小体的可溶性组分中孵育过并纯化出来的重组诱饵蛋白，该实验同样也可以通过pulldown测试来完成。 图 2.分离天然的（A）和重组组蛋白（B）的纯化方案。 ? 从组织培养细胞中纯化天然组蛋白的一个普遍的方法是用微球菌核酸酶（MNase）限制性消化或者机械打断来产生寡聚核小体大小的染色质片段，然后将片段在羟磷灰石(层析)柱上进行色谱分析并在高盐中洗脱（图2A）。当重组组蛋白以单体形式过度制备时是不可溶的，但是可以从包涵体中回收过表达的蛋白（图2B）。首先，可以从分别过表达每种组蛋白的细菌培养物中得到包涵体。组蛋白再从包涵体中提取出来，经连续离子交换树脂纯化，并采用线性盐梯度进行洗脱。要生成组蛋白八聚体的话，等摩尔的H3，H4，H2A和H2B要先展开、组合、通过透析复性，再经分级柱纯化。 ⑥组蛋白翻译